论文摘要
一、研究背景衰老是人类的自然进程,而延缓衰老是科学领域热门的主题。根据现代生物学的推算,人的寿命为性成熟期的8～10倍（即100～150岁）。目前全世界平均寿命约为61岁,发达国家平均为70岁,日本为78岁。可见当今人类的寿命还远远没有达到自然寿命的期限。现代医学研究认为,衰老细胞的死亡实质上就是细胞凋亡。细胞凋亡是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程。在诸多凋亡的诱因中,体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡。细胞凋亡通过两种形式对衰老起作用:①清除己经受损的和功能障碍的细胞（如肝细胞、成纤维细胞）,被纤维组织替代,继续保持内环境稳定;②清除不能再生的细胞（如神经元、心肌细胞）,它们不能被替代,导致病理改变。通过以上机制,细胞凋亡的结果使体细胞特别是具有重要功能的细胞如脑细胞、心肌细胞数量减少,造成其组成的重要器官如脑皮层、心室肌等发生老年性病理过程。已有研究证实,通过干预心肌细胞凋亡能在一定程度上保护心肌细胞。因此,人们在研究药物对心肌细胞凋亡影响方面产生了浓厚的兴趣。国内外学者对传统意义上心血管疾病常用药,如β-受体阻滞剂,血管紧张素转换酶抑制剂等代表性药物研究发现,在动物实验中,它们都能明显抑制心肌细胞凋亡。长期以来,中药在心血管疾病的治疗中占据了一定的地位。目前,中药与心肌细胞凋亡相关性的研究正受到普遍关注,并取得了一些可喜的成果,其研究正在不断深入,尤其在探索中药有效单体成分对心肌细胞凋亡的影响方面。本单位对银耳多糖的实验研究证实,银耳多糖具有清除氧自由基,抗脂质过氧化的作用。因此我们推测,银耳多糖也具有抗心肌细胞凋亡的作用。在本课题中,我们利用现代药理学、细胞生物学、组织化学等研究手段,通过模拟体内心肌细胞氧化损伤过程,建立H2O2诱导体外培养心肌细胞凋亡模型,观察银耳多糖对氧化损伤诱导的体外培养心肌细胞凋亡的影响,并通过动物体内实验,进一步研究银耳多糖对衰老模型小鼠心肌的抗凋亡作用,从而为明确银耳多糖抗凋亡与抗衰老的作用机制及其临床应用价值奠定基础。二、目的1、从细胞及动物整体水平研究银耳多糖抗心肌细胞凋亡的作用。2、研究银耳多糖抗心肌细胞凋亡的最佳作用剂量。3、为银耳多糖抗衰老作用的临床应用提供实验依据。三、方法1、银耳多糖粗品的精制与测定银耳烘干及碾磨后,将去除了部分杂蛋白、色素、脂肪类物质的银耳粉溶解离心后,获得银耳多糖的浸提液。将得到的银耳粗多糖加水溶解成接近饱和状态,离心去除少量不溶物后,装入预先处理好的透析袋,然后醇析、干燥。气相色谱法检测银耳多糖纯度。2、银耳多糖对氧化损伤诱导心肌细胞凋亡的影响将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组:①正常对照组（A组）;②H2O2诱导凋亡模型组（B组）;③银耳多糖干预组（C组）,使用倒置光学显微镜对各组心肌细胞进行形态学观察,并进行台盼蓝摄取率测定。Annexin V-FITC/PI双染法标记凋亡心肌细胞,采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡指数。3、D-半乳糖腹腔注射造成动物衰老模型,并用TP进行干预按体重将小鼠随机分为5组:正常对照组（N组）腹腔注射生理盐水,其余四组每天按120 mg/kg腹腔注射D-半乳糖,同时,低剂量（L组）、中剂量（M组）、高剂量（H组） TP组分别每天灌胃100、200、400 mg/kg TP,衰老对照组（C组）灌胃生理盐水。8w后,处死小鼠,获取心肌标本,进行心肌组织学研究:HE染色和衰老相关半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、TUNEL法原位检测凋亡细胞,并对心肌组织匀浆各生化指标,包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、脂褐质（LP）等进行定量检测。四、结果1、经气相色谱法鉴定,得到的银耳多糖精品含糖量达80%左右,其中糖醛酸含量为13.38%;2、细胞水平研究:（1）各组培养的乳鼠心肌细胞具有不同的形态学特点;（2）各组心肌细胞的台盼蓝摄取率不同,B组的台盼蓝摄取率高于A组（P<0.05）;C组的台盼蓝摄取率低于B组（P<0.05）;C组的台盼蓝摄取率高于A组（P<0.05）;（3）各组心肌细胞的凋亡指数不同,B组的细胞凋亡指数高于A组;C组的细胞凋亡指数低于B组（P<0.05）;C组细胞凋亡指数高于A组（P<0.05）;3、动物实验:（1）各组小鼠光镜下心肌病理学检查结果:肉眼观,各组小鼠心脏外观光滑红润,无明显病理改变;光镜下,与正常组小鼠心肌相比,衰老对照组及各TP干预组均无明显病理学改变;（2）SA-β-Gal染色:阴性细胞的细胞核伊红复染为红色,而阳性细胞的胞浆染为靛蓝色或紫蓝色,采用半定量计分法计算各自分值。统计结果表明,衰老对照组与各TP干预组的分值均高于正常组心肌（P<0.05）,即阳性细胞数高于正常组,提示D-半乳糖注射法建立小鼠衰老模型成功。在各TP干预组中,H组（400mg/kg）分值最低（P<0.05）,即该组阳性细胞数最少,衰老相关半乳糖苷酶活性最低。（3）TUNEL法原位检测凋亡细胞:正常组（N组）心肌细胞凋亡指数低于其余各组,分别与衰老对照组（C组）、100mg/kg组（L组）、200mg/kg组（M组）、400mg/kg组（H组）比较差异有显著意义（P < 0.05）;L组与衰老对照组C组比较,尽管细胞凋亡指数有差异,但二者之间差异没有显著意义（P > 0.05）。M、H组细胞凋亡指数均低于衰老对照组,且差异有统计学意义（P < 0.05）。（4）TP对各组小鼠心肌组织匀浆的抗氧化作用的效果:N组（正常对照组）及各TP干预组组织匀浆中MDA与LP含量低于C组（衰老对照组）,并有显著性差异（P<0.05）,而N组及各TP干预组组织匀浆中GSH-Px与SOD活性高于C组（P<0.05）。同时,M组（200 mg/kg）与H组（400 mg/kg） TP干预组的MDA含量低于L组（100 mg/kg）,而其GSH-Px与SOD活性高于L组,并有显著性差异（P<0.05）,各TP干预组的MDA含量及GSH-Px与SOD活性与TP的剂量呈一定的量效关系。五、结论1、本实验室自行建立的银耳多糖精制与提取技术,能够获得较高纯度的银耳多糖。2、银耳多糖能抑制氧化损伤诱导的体外培养乳鼠心肌细胞凋亡的发生,对心肌细胞具有保护作用。3、采用D-半乳糖腹腔注射法可以成功建立衰老小鼠模型;4、银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠心肌具有抗凋亡和抗氧化作用。5、银耳多糖的抗心肌细胞凋亡和抗氧化作用具有剂量效应关系。