基于杆状病毒表面展示技术的流感病毒NP疫苗研究

论文摘要

流感病毒的核蛋白（nucleoprotein, NP）高度保守,具有型特异性,能够诱导产生细胞介导的免疫应答,从而起到保护作用,抵抗不同亚型流感病毒的攻击。本研究主要利用杆状病毒表面展示技术,使用杆状病毒GP64蛋白的信号肽（signal peptide, SP）和胞质尾（cytoplasmic tail, CT）,展示了甲型流感病毒（A/Hubei/1/2010H5H1）的NP蛋白,并对该NP蛋白的免疫原性和保护机制进行了探讨。利用RT-PCR技术,从A/Hubei/1/2010H5N1禽流感病毒中扩增获得NP基因,并通过重叠PCR技术,将NP基因与杆状病毒GP64的SP和CT串联,获得SP-NP-CT基因。将串联基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBac Dual,获得重组质粒pFastBac Dual-SP-NP-CT。接下来将重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素,庆大霉素和四环素三重抗生素筛选后,获得重组穿梭质粒SP-NP-CT-Bac。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒NP-Bac。纯化重组病毒NP-Bac,利用Western blot试验和免疫电镜试验对杆状病毒表面展示的NP蛋白进行检测及定位。定量NP蛋白,进行动物免疫实验和攻毒实验（攻击25ul10405TCID50/ml A/PR/8/34H1N1流感病毒）,对该NP蛋白的免疫原性和保护性进行了评价。Western blot试验证明NP蛋白在Sf9昆虫细胞中获得了有效的表达。免疫电镜试验显示NP蛋白己成功展示在杆状病毒表面。ELISA结果证明NP疫苗可以诱导产生高水平的IgG抗体。ELISPOT结果筛选出4条肽（Pep7：NP49-66LSDYEGRLIQNSITIERM; Pep8:NP57-74IQNSITIERMVLSAFDER; Pep55:NP433-450TEGRTSDMRTEIIKMMES和Pep56:NP441-458RTEIIKMMESA-RPEDLSF）,实际包括两个NP表位（NP57-66IQNSITIERM和NP441-450RTEIIKMMES）可以诱导小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ,同时证明NP蛋白也可以诱导产生IFN-Y。利用Pep8,Pep56和NP蛋白作为刺激原进行流式细胞试验,对抗原特异性T细胞进行了检测,结果证明Pep8,Pep56和NP均可刺激CD4+和CD8+诱导产生IFN-γ,主要以CD8+诱导为主,Pep56诱导能力最强。攻毒实验证明：该疫苗能够降低小鼠肺病毒载量（P<0.001）,减轻肺组织损伤,降低体重下降率,具有50%的交叉保护作用。本研究利用杆状病毒表面展示技术展示的NP蛋白,不仅可以诱导产生体液免疫反应,还可以产生细胞介导的免疫反应,能够通过降低病毒载量起到交叉保护作用,抵抗不同亚型流感病毒的攻击。

论文目录

• 英汉縮略语名词对照
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 基于NP通用型流感疫苗研究进展
• 2 杆状病毒表面展示技术
• 3 本研究的目的和意义
• 1 材料
• 1.1 病毒,细胞和质粒
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 主要试剂配制
• 2 方法
• 2.1 引物的设计和合成
• 2.2 目的基因的RT-PCR扩增
• 2.3 重组质粒pFastBac Dual-SP-NP-CT的构建及鉴定
• 2.4 重组质粒SP-NP-CT-Bac的构建及鉴定
• 2.5 转染Sf9昆虫细胞
• 2.6 Western blot检测
• 2.7 病毒的扩大培养及纯化
• 2.8 病毒负染及免疫电镜试验
• 2.9 蛋白定量
• 2.10 动物免疫及攻毒实验
• 2.11 脾淋巴细胞的分离和肺组织的处理
• 2.12 ELISA检测NP特异性IgG抗体
• 2.13 ELISPOT筛选NP肽库
• 2.14 流式细胞技术检测抗原特异性T细胞
• 50试验'>2.15 TCID₅₀试验
• 2.16 肺组织病理形态学观察
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.2 重组质粒的酶切及PCR鉴定结果
• 3.3 测序结果
• 3.4 Western blot检测结果
• 3.5 透射电镜观察结果
• 3.6 免疫小鼠血清中抗NP IgG抗体的检测结果
• 3.7 ELISPOT对NP肽池的筛选结果
• 3.8 流式细胞技术对抗原特异性T细胞检测结果
• 50试验测定病毒载量结果'>3.9 TCID₅₀试验测定病毒载量结果
• 3.10 小鼠肺组织病理变化结果
• 3.11 攻毒后小鼠体重变化
• 3.12 NP疫苗的免疫保护性评价结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在研期间发表的论文