急性脑损伤大鼠NF-κB表达的动态观察及CCK-8对其抑制作用的研究

论文摘要

目的:颅脑外伤（trauma brain injury, TBI）后继发脑水肿是危及生命和影响病人预后的一个重要危险因素,伤后引起的机体炎症反应是造成脑水肿的主要原因。有研究表明炎性介质、细胞因子的大量表达与脑组织的继发损伤程度密切相关。核转录因子-κB（Necular Factor Kappa B, NF-κB）是炎症反应调节过程中一个至关重要的转录因子,NF-κB的活化可通过激起肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白介素-1（interleukin-1, IL-1）等促炎因子的表达,进而加重颅脑外伤后的继发性炎性损害。胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）是一种典型的脑肠肽,近年来许多学者发现胆囊收缩素-8具有抑制炎症反应的作用,并作为一种新型的抗炎因子被广泛应用,但目前国内外还没有将其运用于急性颅脑损伤方面的研究。为此我们通过建立稳定的大鼠脑挫伤动物模型,观察NF-κB在脑损伤后脑组织中的动态表达,并对脑损伤大鼠应用CCK-8,检测挫伤侧脑组织含水量及NF-κB的表达变化,对其作用机制进行初步探讨。方法:成年雄性SD大鼠104只,体重250～300 g,随机分为4组,采用液压打击致伤法制作大鼠脑外伤模型。假手术组（8只）,大鼠只行颅骨开窗,不做液压打击;损伤组（48只）,按损伤后时间分为1h、6 h、12 h、24h、72 h、5d六个亚组,每亚组8只大鼠;CCK-8治疗组（24只）,根据NF-κB在伤后表达最强的时间三个点12 h、24h、72h,分为三个亚组,每亚组8只大鼠。于致伤前30min,按40μg/kg,经尾静脉注射CCK-8,0.2ml/只;生理盐水治疗组（24只）,分为伤后12 h、24h、72h三个亚组,于致伤前30min注射等量生理盐水,0.2ml/只,后制作大鼠脑挫伤模型。将动物按时间点断头处死,取挫伤灶前缘2mm处脑皮质100μg,放于-70℃冰箱保存,采用电泳迁移率改变分析方法（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）检测胞核内NF-κB蛋白的表达,并做光密度定量分析;另取挫伤灶边缘脑皮质约（200±50）mg,用干湿重法测量脑含水量;剩余挫伤边缘脑组织用4%多聚甲醛固定、脱水、包埋。将脑组织切成4 mm厚薄片,用做苏木精-伊红染色观察脑组织形态学变化,以及免疫组化方法观察脑挫伤后不同时间大鼠脑组织表达NF-κB的情况。结果:1脑含水量变化损伤组大鼠脑外伤后1h损伤侧脑组织含水量与假手术组相比虽然有所升高,但经统计学分析无显著性差异, P>0.05。从伤后6h开始损伤侧脑组织含水量较假手术组有所升高,伤后12h脑组织脑含水量明显升高,24h脑组织含水量达到高峰为（85.70±1.41） %,高峰持续到72h,而后开始下降。5d后明显降低脑组织含水量为（77.29±1.57）%。CCK-8治疗组各时间点脑组织含水量与生理盐水治疗组比较,有明显的降低, P<0.05,差异具有统计学意义。2炎症反应情况假手术组大鼠脑组织无炎细胞浸润。脑损伤组大鼠伤后1h病变周围未发现明显炎细胞浸润情况,伤后6h挫伤组织周围开始出现散在的炎细胞,并可见大量炎性细胞在血管腔内聚集,向外迁移。伤后12 h可见挫伤组织缺血坏死明显,与周围正常组织边界清楚,挫伤周围出现深染的单核淋巴细胞浸润;伤后24h炎性细胞浸润继续多以单核细胞为主,并可见少量中性粒细胞。伤后72h炎性细胞大量集聚于坏死组织及坏死组织周边,以分叶核的中性粒细胞为主,胶质细胞增生明显,在坏死区内开始有新生毛细血管生成。伤后5d胶质细胞大量增生,残留坏死组织基本被吸收完全,成纤维细胞增多,炎性细胞较前有所减少。CCK-8治疗组各时间点脑组织切片经HE染色,可见炎性细胞数量较损伤组及同时间点生理盐水组有明显减少,神经细胞水肿及坏死程度也有显著减轻。3 NF-κB的阳性表达假手术组脑组织仅有微量NF-κB阳性细胞表达。脑损伤组大鼠脑损伤后1h NF-κB阳性细胞表达开始增多,阳性细胞数为10.00±1.52。伤后6h阳性细胞数明显增加,在挫伤区及挫伤周围脑组织均可见到阳性细胞表达,阳性细胞数为17.56±2.40。12h阳性细胞急剧增多,主要集中在挫伤组织边缘,然后随着时间的推移,挫伤灶周围的阳性细胞越来越多,至24 h达到高峰,为38.00±1.76,72h后阳性细胞表达开始减少,但仍明显高于假手术组,到5d时明显减少,基本趋于稳定。脑损伤组大鼠脑组织挫伤后病变侧各时间点阳性细胞数与假手术组比较,有统计学意义,F值为200.967,P<0.05。CCK-8治疗组与生理盐水治疗组各相应时间点比较,阳性细胞表达数量明显减少,P<0.05,差异具有统计学意义。4 EMSA电泳条带光密度值分析损伤组伤后各时间点大鼠脑组织细胞核中NF-κB蛋白含量与假手术组大鼠比较均有显著增高。而CCK-8治疗组与生理盐水治疗组相应时间点比较,NF-κB的含量明显下降,差异具有统计学意义,P<0.05,这一结果与免疫组化结果相一致。结论:大鼠急性脑损伤后挫伤脑组织周围NF-κB的表达与炎性细胞浸润数量及脑含水量的增加在时间上具有一致性,提示NF-κB的表达参与了脑挫伤后神经元继发性炎症损害过程,而CCK-8治疗组NF-κB阳性表达及脑含水量较生理盐水治疗组比较有明显减少,说明CCK-8可通过抑制NF-κB的活化,有效减轻脑损伤后继发性炎性反应对脑组织的损害。

论文目录

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• 研究论文 急性脑损伤大鼠NF-κB 表达的动态观察及CCK-8对其抑制作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
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