基因枪介导的LEA3基因对石斛的遗传转化研究

论文摘要

石斛属是兰科第一大属，全球约有1600多种。其中多数种具观赏价值，称为石斛兰，既可作盆花又可作切花，为四大观赏兰之一，具有极高的观赏价值和经济价值。本研究以铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall．ex Lindl）为材料，应用基因枪法进行了遗传转化研究，旨在将抗旱、耐脱水基因lea3导入石斛兰，改良兰花品质，培育耐旱、耐脱水兰花新品种，提高盆栽兰花的耐旱性，延长兰花切花的瓶插期。研究结果如下：在暗处对铁皮石斛类原球茎进行了驯化培养，确定类原球茎的快速增殖期为3～5周，继代周期为35天，分化取材时间为28天，转化受体取材时间为25天。通过不同条件的比较研究，获得了植株分化体系。苗分化的优化条件是：MS+NAA 0.9mg／L+6-BA 1.0mg／L+蔗糖3％+琼脂粉5.5g／L，类原球茎分化不定芽高达56.50个／g（为对照的27.29倍）。根分化优化条件是：MS+20％香蕉泥+蔗糖3％+琼脂粉5.5g／L，再生芽生根率高达95％，每苗平均根条数达5.05条。考察了基因枪法遗传转化铁皮石斛的有关影响因素，确定的参数为：轰击前，类原球茎光照预分化培养10天，轰击后过渡培养20天，轰击次数为每皿1次；确定的筛选条件为：转化的类原球茎PPT筛选压力为3mg／L，筛选2个月，转化的再生不定芽PPT筛选压为20mg／L，筛选1个月。获得了转lea3基因植株：轰击后的类原球茎恢复培养20天，经3mg／L PPT筛选两个月，转入不含PPT的高效分化培养基分化45天，获得的再生芽再经20mg／L PPT筛选一个月，然后转入高效生根壮苗培养基培养40天，获得转化再生植株35株；对其进行除草剂叶片涂抹检测，获得了11株具PPT抗性的转化再生植株，经PCR检测，其中7株扩增出了目的基因片断，证实lea3已整合到铁皮石斛基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物胚胎发育后期丰富蛋白基因及应用
• 1.1.1 植物胚胎发育后期富集蛋白（LEA）
• 1.1.2 植物胚胎发育后期富集蛋白基因（lea）
• 1.1.3 Lea基因的应用
• 1.2 兰科植物转基因研究
• 1.2.1 转基因受体材料
• 1.2.2 应用的转基因方法
• 1.2.3 转入的报告基因和目的基因
• 1.2.4 转基因组织的筛选与检测
• 1.3 本研究的目的、意义及技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 主要生化试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 主要培养基
• 2.1.6 主要溶液及其组成
• 2.1.7 PCR扩增引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 铁皮石斛再生体系的建立和优化
• 2.2.2 基因枪转化
• 2.2.3 转基因植株的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 铁皮石斛再生体系的建立和优化
• 3.1.1 类原球茎的获得、驯化及状态调整
• 3.1.2 不定芽的诱导
• 3.1.3 生根壮苗培养
• 3.1.4 再生植株的驯化及移栽
• 3.2 基因枪转化
• 3.2.1 除草剂（PPT）对未转化类原球茎亚致死剂量的确定
• 3.2.2 除草剂（PPT）对未转化不定芽致死剂量的确定
• 3.2.3 除草剂（PPT）对未转化植株致死剂量的确定
• 3.2.4 受体材料预分化处理对基因枪法转化铁皮石斛的影响
• 3.2.5 过渡培养时间对基因枪法转化铁皮石斛的影响
• 3.2.6 轰击枪数对基因枪法转化铁皮石斛的影响
• 3.2.7 Lea3基因的导入、抗性类原球茎的筛选及转化植株的再生
• 3.3 转化再生植株的检测
• 3.3.1 转化再生植株bar基因表达检测
• 3.3.2 转化再生植株总 DNA的 PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 影响铁皮石斛再生体系建立的因素
• 4.1.1 类原球茎驯化及状态调整
• 4.1.2 植物激素及其组合和多胺对类原球茎分化的影响
• 4.1.3 植物激素和天然附加物对壮苗生根的影响
• 4.2 基因枪法介导遗传转化的影响因素
• 4.2.1 受体组织或细胞的状态对转化率的影响
• 4.2.2 轰击参数对转化率的影响
• 4.2.3 轰击后过渡培养、选择压的大小和选择培养的时间对转化率的影响
• 4.3 转基因植株的检测
• 4.4 后期工作
• 5 结论
• 5.1 建立了铁皮石斛高效再生体系
• 5.2 优化了遗传转化体系
• 5.3 获得了转lea3基因植株
• 参考文献