四环素类阻抗型免疫电化学检测方法的研究

论文摘要

四环素类（Tetracyclines,TCs）抗生素是由链霉菌产生的一类广谱抗生素,常用于各种动物传染性疾病的治疗以及动物生长促进剂。动物性食品中TC滥用及超标残留给人类健康带来了严重威胁,因此,迫切需要研究能对其进行快速准确的检测方法。本课题合成了TC完全抗原,制备了TC特异性抗体,以此为基础,建立了快速、准确、灵敏的TC残留阻抗型免疫电化学传感检测方法。合成了TC完全免疫原和包被原。对TC苯环上4位和7位碳原子衍生化后,通过重氮化法分别合成了TC免疫原和包被原。同时对载体蛋白BSA进行了羧基化,减少BSA自身的偶联,提高所合成抗原的纯度及偶联比。经过HPLC-MASS、凝胶色谱、红外图谱、紫外图谱鉴定,免疫原和包被原均合成成功,且由羧基化的BSA制备的免疫原（TC-aBSA）比未经羧基化的BSA制备的免疫原（TC-BSA）偶联比高,分别为11:1和7:1,包被原的偶联比为5:1。制备了TC特异性抗体并通过间接竞争ELISA方法对抗体进行了表征。用制备的TC免疫原TC-BSA和TC-aBSA各免疫两只新西兰大白兔,其中三只产生了针对TC的抗血清,经硫酸铵法初步纯化后,效价分别为14.4万、25.6万、32万左右。取效价为32万的抗血清建立间接竞争ELISA法,测得OD450值与TC标准品浓度在40～120 ng/kg范围内呈线性关系,线性回归方程为:Y=-0.0064X+1.1308,R2=0.9937,TC的半数抑制率IC50为97μg/kg,与土霉素（OTC）、金霉素（CTC）的交叉反应率分别为100%和85%。建立了基于阻抗技术和纳米材料的电化学免疫传感检测方法。以制备的TC抗体为识别元件,通过L-半胱氨酸（L-Cys）和纳米金（Nano-Au）自组装技术设计传感器界面固定抗体,通过电化学交流阻抗技术,建立了快速、准确、灵敏的TC免疫电化学传感检测方法。实验得出工作电极修饰的最佳条件如下:L-Cys自组装浓度为0.5%,pH值为4.5,时间为2 h;自组装Nano-Au粒径为20 nm,pH 6.0;抗体包被浓度为100μg/mL,pH 7.0,时间为1 h;1% BSA封闭时间为40min;优化后阻抗测定初始电压为0.2 V。本方法室温下检测时间为15 min,对TC的响应线性范围为5～85μg/kg,最低检测限1μg/kg。鸡肉中样品加标回收率平均为79.37%,工作电极保存一个月以内性能稳定,偏差在5%以内。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 TC 概述
• 1.1.1 TC 理化性质
• 1.1.2 TC 残留对人体的危害
• 1.1.3 食品中TC 残留现状
• 1.1.4 TC 残留的有关国家标准
• 1.1.5 TC 残留现有检测方法及局限
• 1.2 阻抗型免疫传感技术
• 1.2.1 电化学免疫传感概述
• 1.2.2 电化学交流阻抗谱
• 1.2.3 交流阻抗的表示方法
• 1.2.4 阻抗型电化学免疫传感器的原理
• 1.2.5 抗体的固定方法
• 1.3 立题意义和研究内容
• 1.3.1 立题意义
• 1.3.2 研究内容
• 第二章 TC 完全抗原的合成与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 BSA 的羧基化（aBSA）
• 2.3.2 TC 免疫抗原的合成
• 2.3.3 TC 包被抗原的合成
• 2.3.4 TC 完全抗原的鉴定
• 2.3.5 完全抗原偶联比的计算
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 TC 免疫抗原合成
• 2.4.2 TC 包被抗原合成
• 2.5 本章小结
• 第三章 TC 多克隆抗体的制备与表征
• 3.1 引言
• 3.2 材料及仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 动物免疫过程
• 3.3.2 抗血清的初步纯化
• 3.3.3 抗体效价的测定
• 3.3.4 最佳包被浓度及抗体稀释度的确定
• 3.3.5 抑制率的测定
• 3.3.6 特异性分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 抗血清产生过程监测
• 3.4.2 纯化后抗血清的效价测定
• 3.4.3 最佳包被浓度及抗体稀释度的确定
• 3.4.4 间接竞争ELISA 抑制率的测定
• 3.4.5 特异性分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 TC 阻抗型免疫传感检测方法的构建
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 溶液的配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 Nano-Au 的合成与表征
• 4.3.2 电极的预处理
• 4.3.3 工作电极的修饰过程
• 4.3.4 工作电极修饰条件的优化
• 4.3.5 阻抗测定参数的优化
• 4.3.6 电化学免疫传感检测参数设定
• 4.3.7 TC 浓度的阻抗响应计算方法
• 4.3.8 传感器选择性测试
• 4.3.9 样品回收率测定
• 4.3.10 工作电极稳定性测试
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 Nano-Au 的合成
• 4.4.2 工作电极的预处理
• 4.4.3 工作电极的修饰过程
• 4.4.4 电极修饰的优化
• 4.4.5 阻抗测定参数的优化
• 4.4.6 免疫传感检测方法响应范围
• 4.4.7 选择性测试
• 4.4.8 样品回收率测试
• 4.4.9 工作电极稳定性测试
• 4.5 本章小结
• 主要结论和展望
• 主要结论
• 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文