苦瓜MAP30蛋白基因克隆、原核表达及其产物纯化和抗肿瘤活性研究

论文摘要

MAP30（Momordica anti-HIV protein of 30 kD）是从苦瓜中分离得到的一种分子量为30 kD的单链、Ⅰ型核糖体失活蛋白。研究表明,MAP30具有抗病毒活性,对急性和慢性病毒感染都非常有效。此外,它还具有抗肿瘤、使病毒DNA拓扑失活、抑制病毒整合酶、核糖体失活以及抗菌等多种生物活性。而且,MAP30的作用具有良好的特异性,只对病毒感染的细胞或肿瘤转化细胞有效,但对人正常细胞无细胞毒性。MAP30这些显著的作用特点,使其有可能发展成为抗病毒、抗肿瘤治疗中最有前景的候选药物。 本研究通过PCR技术,从苦瓜总DNA中扩增出编码MAP30成熟蛋白的基因,经过测序证明完全正确后亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建成带有N-端6His-tag的融合表达载体。表达载体用CaCl2介导的化学转化法转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,然后利用PCR筛选阳性克隆。工程菌经1mmol/L IPTG诱导4h实现表达,而且在30℃时融合蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的56%。该融合蛋白在大肠杆菌中主要以可溶的形式存在。通过镍鏊合亲和层析进行一步纯化,纯化蛋白占上清总蛋白的37.2%,发酵液产率为250 mg/L。Western blot分析表明,重组蛋白具有免疫原性,可与兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性反应。利用MTT法分析重组MAP30的细胞毒性,结果表明其对小鼠3T3和S-180肿瘤细胞株具有明显的抑制作用,抑制效果呈剂量依赖关系,ID50分别约为50 μg/ml和3.0mg/ml,但对人正常胚肺二倍体WI-38细胞株的毒性极小。 通过大肠杆菌制备的重组MAP30具有很好的抗肿瘤活性,这为继续研究其抗病毒功能,以及开展重组MAP30的中试研究,并最终将其开发成新型抗病毒、抗肿瘤基因工程药物奠定了良好的基础。

论文目录

• 第一章 前言
• 1 新型抗病毒抗肿瘤苦瓜蛋白MAP30的研究进展
• 1.1 MAP30的结构
• 1.2 MAP30的药理作用
• 1.2.1 抗病毒
• 1.2.2 抗肿瘤
• 1.2.3 抗菌
• 1.2.4 细胞毒性
• 1.3 MAP30的作用机理
• 1.3.1 RNA N-糖苷酶活性
• 1.3.2 DNA拓扑失活活性
• 1.3.3 抑制HIV-1整合酶活性
• 1.3.3.1 抑制HIV-1整合酶的3’末端加工活性
• 1.3.3.2 抑制HIV-1整合酶的链转移活性
• 1.3.3.3 抑制HIV-1整合酶的去整合活性
• 1.4 MAP30的重组生产
• 1.5 展望
• 2 大肠杆菌表达系统的研究进展
• 2.1 表达载体
• 2.1.1 复制子
• 2.1.2 抗性标记
• 2.1.3 启动子
• 2.1.4 转录终止子
• 2.2 表达宿主菌
• 2.2.1 蛋白酶缺陷型菌株
• 2.2.2 还原酶突变型菌株
• 2.2.3 氨基酸营养缺陷型菌株
• 2.2.4 补充稀有密码子型菌株
• 2.2.5 其他类型菌株
• 2.3 重组蛋白的定位表达
• 2.3.1 细胞质表达
• 2.3.1.1 以可溶形式表达
• 2.3.1.2 以包涵体形式表达
• 2.3.2 分泌表达
• 2.3.2.1 分泌到细胞周质空间
• 2.3.2.2 分泌到培养基
• 2.3.2.3 细胞表面展示
• 2.4 pET表达系统简介
• 3 本研究的意义、目的
• 4 实验技术路线
• 5 大肠杆菌表达载体构建示意图
• 第二章 MAP30基因克隆及其原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 主要生化试剂
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 苦瓜总DNA的提取
• 1.2.3 MAP30基因的克隆
• 1.2.3.1 PCR扩增MAP30基因
• 1.2.3.2 PCR扩增产物回收
• 1.2.4 克隆载体的构建及鉴定
• 1.2.4.1 PCR回收产物与克隆载体T-easy Vector的连接
• 1.2.4.2 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 1.2.4.3 连接产物转化感受态细胞
• 1.2.4.4 重组质粒的提取
• 1.2.4.5 重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.4.6 重组质粒的序列分析
• 1.2.5 表达载体的构建及鉴定
• 1.2.5.1 MAP30基因的制备
• 1.2.5.2 表达载体pET30a的制备
• 1.2.5.3 MAP30基因与表达载体的连接
• 1.2.5.4 连接产物的转化及鉴定
• 1.2.6 工程菌BL21（DE3）／pET-30a-MAP30的构建与筛选
• 1.2.6.1 pET-30a-MAP30质粒的制备
• 1.2.6.2 E.coli BL21（DE3）感受态细胞的制备及转化
• 1.2.6.3 菌落PCR筛选阳性克隆
• 1.2.7 MAP30基因的诱导表达
• 1.2.8 重组蛋白SDS-PAGE分析
• 1.2.9 重组蛋白可溶性分析
• 1.2.10 最佳诱导温度分析
• 2 结果与分析
• 2.1 苦瓜总DNA的提取
• 2.2 MAP30基因的扩增
• 2.3 克隆载体pGEM-MAP30的构建
• 2.4 表达载体pET-30a-MAP30的构建
• 2.5 工程菌株BL21（DE3）／pET-30a-MAP30的构建
• 2.6 目的基因的诱导表达
• 2.7 最佳诱导温度分析
• 2.8 重组MAP30可溶性分析
• 3 讨论
• 第三章 重组MAP30蛋白的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要化学试剂
• 1.1.3 缓冲液
• 1.1.4 主要实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 工程菌的摇瓶发酵
• 1.2.2 发酵液的处理
• 1.2.3 亲和层析分离重组MAP30蛋白
• 1.2.4 SDS-PAGE分析纯化组分
• 1.2.5 Western blot分析重组蛋白
• 2 结果与分析
• 2.1 分离纯化
• 2.2 Western blot检测
• 3 讨论
• 第四章 重组MAP30蛋白抗肿瘤活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 细胞培养用液
• 1.1.3.1 灭活小牛血清
• 1.1.3.2 青霉素、链霉素（双抗液）
• 1.1.3.3 RPMI-1640基础培养基
• 1.1.3.4 RPMI-1640血清细胞培养基
• 1.1.3.5 Hanks液
• 1.1.3.6 0.25％胰蛋白酶
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.1.1 细胞复苏
• 1.2.1.2 细胞传代
• 1.2.2 生物活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 细胞形态观察
• 2.2 MTT活性分析
• 3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢