论文摘要
神经胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,具有播散和浸润的特征,其恶性程度高,患者生存期短,是中枢神经系统肿瘤相关性死亡的首要原因。虽然针对胶质瘤的手术及辅助治疗已取得了很大进展,但这未能有效地改善恶性胶质瘤的病死率。关于胶质瘤的起源至今还不是很明确。近年来,随着神经干细胞（neuralstem cell,NSC）的发现,以及造血系统肿瘤和乳腺癌中肿瘤干细胞的成功分离和证实,肿瘤发生的干细胞学说引起了肿瘤研究者的极大关注。肿瘤干细胞学说认为,在肿瘤中并不是所有的而仅是一小部分肿瘤细胞,具有无限增殖和自我更新的能力来维持肿瘤的生长,这部分细胞被称为肿瘤干细胞。目前有多个研究小组已分别成功地在多种类型胶质瘤标本中分离出脑肿瘤干细胞（brain tumor stemcell,BTSC）。这些BTSC具有高度的自我更新和增殖能力,并且在用于分离NSC的无血清培养基中呈悬浮生长。它们表达NSC的标志物CD133和Nestin,并且在适当的条件下可分化为神经元和胶质细胞。虽然目前对于BTSC的研究已取得了一定进展,但对于参与形成和维持BTSC的分子机制尚不清楚。最近有学者提出,肿瘤干细胞来自于自我更新失调的正常干细胞,或是重新获得自我更新能力的祖细胞或已分化细胞。自我更新的失调可能在肿瘤发生过程中起关键作用。因此,在肿瘤发生过程中,对于干细胞自我更新调节基因的研究就变得十分重要。目前已发现多个调节干细胞自我更新的转录因子在肿瘤中异常激活,并在肿瘤的发生和维持中起重要作用。Oct4（octamer transcription factor 4）,又称为Oct3或POU5f1,属于POU转录因子家族的成员,是胚胎干（embryonic stem,ES）细胞自我更新和分化最重要的调节因子之一。Oct4只表达于具有多能性的胚胎细胞中,其中包括内细胞群,原肠胚的外胚层细胞,原始生殖细胞（primordial germ cell）,及它们体外培养的对应物,如ES细胞和胚胎性生殖细胞。当这些细胞开始分化时,Oct4的表达开始下调;Oct4不表达于已分化的细胞中。在小鼠中敲除Oct4基因会使内细胞群分化为滋养层细胞而导致小鼠的早期死亡。这些都表明Oct4在ES细胞的自我更新和全能性维持方面起着关键性作用。最近的研究表明,Oct4还具有致癌作用。Oct4是诱导已分化细胞成为干细胞样细胞的四个关键性因子之一。有学者发现,Oct4不仅表达于具有多能性的胚胎细胞中,而且表达于成体组织的干细胞中,并且这些表达Oct4的成体干细胞是肿瘤发生中的靶细胞。Oct4在上皮组织中的持续表达可阻止上皮组织祖细胞的分化而导致发育异常。Oct4的过表达可增加ES细胞来源的肿瘤的恶性程度,而抑制Oct4的表达则降低其恶性程度。最近发现Oct4表达于多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中,如生殖细胞肿瘤,肝癌,乳腺癌,膀胱癌等,但是关于Oct4在胶质瘤中的表达目前尚无报道。在本研究中,我们利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）,Western Blot和免疫组织化学技术检测Oct4基因在胶质瘤中的表达,并且检测Oct4的表达水平与胶质瘤恶性程度的关系。此外,利用质粒转染和RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,我们进一步分析了Oct4在胶质瘤发生中的作用及可能的作用机制。第一部分Oct4在胶质瘤中的表达及与胶质瘤恶性程度的关系为检测Oct4在胶质瘤中的表达,我们共收集了41例被诊断为原发性胶质瘤的临床标本。所有的胶质瘤标本均经过最后的病理诊断证实,并按照世界卫生组织（World Health Organization,WHO）制定的分级标准进行病理分级。标本中分别有14例低级别（WHOⅡ级）和27例高级别恶性程度（WHOⅢ,Ⅳ级）的胶质瘤。作为正常对照的人脑组织标本取自于5例脑外伤病人。实验中,我们分别提取了41例胶质瘤标本和5例正常脑组织的总RNA和总蛋白,利用半定量RT-PCR和Western Blot方法,分别检测了Oct4在不同恶性程度胶质瘤标本和正常脑组织中mRNA和蛋白的表达水平;利用免疫组织化学技术,从形态学上检测了Oct4蛋白在不同恶性级别胶质瘤组织中的表达。RT-PCR结果显示,Oct4 mRNA在41例胶质瘤标本中都有表达,并且Oct4的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增加而升高。然而在5例正常脑组织标本中未检测到明显的Oct4的表达。Western Blot的结果与RT-PCR的结果相一致。免疫组织化学结果显示,Oct4阳性染色主要位于肿瘤细胞的胞核部位,并且恶性程度高的肿瘤标本染色强度高于恶性程度低的标本;正常脑组织中未检测到Oct4的阳性染色。这些结果表明,胚胎性基因Oct4高表达于胶质瘤中,并且表达水平随着胶质瘤恶性程度的增加而升高。此外,我们还利用免疫荧光法检测了Oct4蛋白在胶质瘤细胞系U87和U251中的表达。免疫荧光结果表明,Oct4同样高表达于U87和U251胶质瘤细胞系中,并且Oct4阳性染色主要位于瘤细胞的胞核部位。根据Oct4的表达特点及其在干细胞全能性维持中所起的关键作用,我们推测在胶质瘤标本及胶质瘤细胞系中存在有干细胞样（stem cell like）瘤细胞,Oct4可能是这些干细胞样瘤细胞的标志物,并参与了这些细胞的形成及未分化状态的维持。第二部分Oct4对C6胶质瘤细胞增殖及克隆形成的作用虽然目前已发现Oct4表达于多种肿瘤组织及肿瘤细胞系中,但是关于Oct4在这些肿瘤中的作用却知之甚少。为研究Oct4在胶质瘤中的作用,我们以胶质瘤经典细胞系C6为体外研究模型,分别构建了Oct4表达上调及下调的模式来研究其在胶质瘤中的作用。我们通过在C6细胞中转染Oct4的表达质粒使该基因过量表达,而转染Oct4特异性小干扰片段来抑制该基因的表达。实验结果显示,质粒转染和RNAi技术都成功地在mRNA和蛋白水平上调节了Oct4的表达,上调和下调效应得到了RT-PCR和Western blot实验的证实。随后,我们从细胞增殖和克隆形成两个方面研究了Oct4在胶质瘤发生及发展中的作用。结果表明,Oct4过表达的肿瘤细胞其增殖能力和克隆形成率均高于野生型瘤细胞,而抑制Oct4表达的肿瘤细胞则具有相反的结果。这说明Oct4可以促进胶质瘤细胞的增殖及自我更新。有研究表明,肿瘤干细胞可能来自于它们相对应组织的正常干细胞。所以,在此部分实验中,我们还通过RT-PCR,Western Blot和免疫荧光技术检测了C6细胞和大鼠成体NSC中Oct4的表达,并设置正常大鼠脑组织,大鼠星形胶质细胞,和大鼠神经元细胞为对照。RT-PCR及Western Blot结果显示,Oct4只表达于NSC和C6中,而在正常大鼠脑组织,大鼠星形胶质细胞和神经元中无表达,并且C6细胞中Oct4的表达量高于NSC。免疫荧光结果显示,Oct4的阳性染色主要位于C6细胞和NSC的胞核部位。C6细胞和NSC中Oct4表达方式的相似性表明NSC更有可能是发生恶变的靶细胞,并且Oct4的过量表达在其恶变过程中可能发挥着促进作用。第三部分Oct4对C6胶质瘤细胞增殖和分化作用的机制研究我们以C6为体外胶质瘤模型,采用与第二部分实验相同的Oct4调节模式,对Oct4在胶质瘤细胞增殖和分化中的作用机制进行了进一步研究。以往研究显示,Stat3（signal transducer and activator of transcription 3,信号转导及转录激活因子3）在胶质瘤及其细胞系中持续性激活,并促进瘤细胞的增殖。Stat3的激活依赖于其705位酪氨酸残基（Tyr705）的磷酸化。为了探讨Oct4在胶质瘤中的作用是否与Stat3有关并由Stat3信号通路所介导,我们分别检测了在Oct4表达上调及下调的模式下Stat3及其磷酸化的表达。结果显示,Oct4可以促进Stat3的磷酸化,但对Stat3蛋白总量无明显影响。随后,我们又检测了Stat3对Oct4表达的影响。我们将Stat3的表达质粒转染到C6细胞中从而上调细胞中Stat3蛋白总量和磷酸化Star3的表达水平。结果表明,转染Stat3表达质粒后的C6细胞比野生型C6细胞增殖快,但细胞中Oct4 mRNA及蛋白表达水平未检测出明显变化。这说明促进Stat3的激活是Oct4下游基因调节中的一个关键性事件。在胶质瘤发生和BTSC形成过程中,Oct4可能通过Stat3信号通路促进肿瘤细胞的生长增殖及自我更新。大量研究报道,Oct4可以抑制ES细胞的分化从而维持ES细胞的全能性。所以,我们推测Oct4可能具有抑制肿瘤细胞分化的作用。神经巢蛋白Nestin和胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）是与胶质瘤分化程度相关的标志物。我们发现,在Oct4表达上调的C6细胞中,Nestin表达增加而GFAP表达下降;然而在Oct4抑制表达的C6细胞中,Nestin表达下降而GFAP表达增加。这说明Oct4可能通过抑制肿瘤细胞的分化而扩增及维持肿瘤干细胞的数量。在本项研究中,我们首次报道了Oct4在胶质瘤中高表达,并且表达水平与胶质瘤的恶性程度成正相关,这使Oct4可能成为胶质瘤诊断和评价治疗效果的重要指标。在体外培养细胞中,Oct4只表达于U87、U251和C6胶质瘤细胞系以及大鼠NSC中,而不表达于神经元和神经胶质细胞。以C6胶质瘤细胞为模型的研究显示,Oct4可促进C6细胞的增殖和克隆形成。进一步的研究表明,Oct4可能通过上调Stat3的磷酸化而促进胶质瘤细胞的增殖;此外,Oct4还可抑制胶质瘤细胞的分化。这说明Oct4可能是一种肿瘤干细胞相关基因,并为肿瘤干细胞学说的研究提供了新的线索。