Smad7通过干扰Smad-DNA复合物的形成抑制TGF-β信号

论文摘要

TGF-β（transforming growth factor-beta）超家族包括TGF-β、Nodal、BMP（bone morphogenetic protein）、activin、inhibin等,它们在体内具有重要而广泛的生物学功能,它们的信号转导失控会引起胚胎发育异常以及包括肿瘤在内的多种疾病的发生。细胞为了维持正常的生理功能,必须对TGF-β信号进行精确的调控。Smad7在TGF-β信号负反馈调控中起着重要的作用。已有研究认为Smad7通过和I型受体结合干扰激活型的R-Smads的结合,或者募集E3泛素连接酶Smurf1和Smurf2到受体导致泛素依赖的方式降解受体,从而在细胞质中的受体水平抑制TGF-β信号。本论文研究发现Smad7具有不同于以往Smad7作用于胞质I型受体水平的在细胞核内的抑制作用,并且它能够通过结合DNA竞争其它功能Smad对目标基因启动子的结合,以及其结合HDAC的能力等多种方式在细胞核内有效的抑制TGF-β信号。完全在胞核中表达的Smad7在哺乳动物细胞中的报告基因系统和斑马鱼胚胎发生中的作用表明在细胞核内存在对TGF-β信号高效的抑制活性。失去Smurf结合活性的Smad7突变体仍然在核内存在抑制作用。进一步研究表明,Smad7在I型受体缺陷的细胞R1B/L17和Hep3B中强烈的抑制Smad3/4和Smad1/4引起的报告基因的表达。生物素标记的DNA结合实验表明Smad7能够特异性的通过MH2结构域结合Smad响应元件。通过染色体免疫共沉淀方法,进一步验证了Smad7可以结合体内响应TGF-β信号的目标基因PAI-1的启动子的DNA结合活性。然后有证据表示Smad7可以干扰TGF-β诱导的功能性Smad-DNA复合物的形成。这些研究提示Smad7以一种全新的机制在细胞核内抑制TGF-β信号。随后,用GAL4检测系统发现Smad7的MH2结构域在Hep3B细胞中的转录抑制活性。免疫共沉淀研究表明Smad7可以和HDAC1和HDAC3结合,而且其结合结构域也是MH2,HDAC可以去掉组蛋白和非组蛋白上的乙酰基从而沉默基因的表达。进而,用HDAC的抑制剂TSA可以部分的回复Smad7对TGF-β信号的抑制作用。这说明Smad7可以通过募集HDAC的方式在细胞核内抑制TGF-β信号。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 TGF-β信号
• 1.1.1 TGF-β信号转导通路
• 1.1.2 TGF-β信号转导的配体
• 1.1.3 TGF-β受体与信号传递
• 1.1.4 Smads 对信号的传递
• 1.1.5 TGF-β信号在细胞核内的转录效应
• 1.2 TGF-β信号传递的调控
• 1.2.1 胞外配体的调控
• 1.2.2 受体的调控
• 1.2.3 胞内信号分子Smads 的调控
• 1.2.4 核内转录调控
• 1.3 Smad7 的研究进展
• 1.3.1 Smad7与TGF-β信号
• 1.3.2 Smad7 对TGF-β信号的调控
• 1.3.3 Smad7 表达水平的调控
• 1.3.4 Smad7 与其它信号通路
• 1.3.5 Smad7 的基因结构与功能
• 1.3.6 Smad7 与TGF-βI 型受体之间的相互作用
• 1.3.7 Smad7 的定位
• 1.3.8 Smad7 蛋白的调控
• 1.3.9 Smad7 在体内的表达谱和作用
• 1.4 研究内容和意义
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 溶液配制
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 细胞转染
• 2.3.3 免疫印迹
• 2.3.4 免疫共沉淀
• 2.3.5 生物素标记DNA 沉淀蛋白
• 2.3.6 凝胶阻滞
• 2.3.7 细胞总RNA 提取及反转录PCR
• 2.3.8 染色体免疫共沉淀
• 2.3.9 报告基因检测
• 2.3.9.1 分细胞及转染
• 2.3.9.2 TGF-β刺激
• 2.3.9.3 收取细胞及数量测定
• 2.3.9.4 数值分析及作图
• 2.3.10 免疫荧光
• 2.3.10.1 盖玻片处理
• 2.3.10.2 细胞染色
• 2.3.11 体外转录和显微注射斑马鱼胚胎
• 第3章 结果和讨论
• 3.1 Smad7 在细胞核内的作用
• 3.1.1 Smad7 的定位和功能
• 3.1.2 核内 Smad7 对TGF-β信号的抑制
• 3.1.3 核内 Smad7 在体内的抑制作用
• 3.1.4 讨论
• 3.2 Smad7 抑制TGF-β信号的作用
• 3.2.1 失去 Smurf 结合活性的Smad7（ΔPY）可以抑制TGF-β信号
• 3.2.2 Smad7 可以不依赖于I 型受体抑制TGF-β信号
• 3.2.3 讨论
• 3.3 Smad7 在细胞核内的抑制机理1
• 3.3.1 Smad7 能够特异性的结合DNA
• 3.3.2 Smad7 可以干扰功能性Smads-DNA 复合物的形成
• 3.3.3 讨论
• 3.4 Smad7 在核内的作用机理2
• 3.4.1 Smad7 具有转录抑制活性
• 3.4.2 Smad7 可以通过与HDAC 相互作用抑制TGF-β信号
• 3.4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果