论文摘要
利用PCR方法扩增出了PRRSV VR2332 resp株的核衣壳蛋白基因（N基因）,并克隆进荧光表达载体pEGFP-N1中,利用卡那抗性筛选得到重组阳性克隆,经双酶切鉴定成功后,命名为pEGFP-N1-ORF7。根据麻省理工学院和Ambion公司网站提供的RNAi靶位点选择软件,以及2004年Nature文献,选定PRRSV VR2332resp株N基因两处靶位点,并且提交NCBI的BLAST系统证明其与其它物种的低同源性后,设计合成六条单链,两两退火后克隆入RNA干扰载体pBS/U6 1.0中,利用氨苄抗性筛选,并经缺失酶切位点XhoI鉴定,得到两个干扰载体pBS/U6-60和pBS/U6-260,以及一个对照载体pBS/U6-Neg。 将真核表达荧光载体pEGFP-N1-ORF7分别与pBS/U6-60,pBS/U6-260以及对照载体pBS/U6-control共转染入293T细胞中,16小时后检测,通过GFP表达数量以及用Western-blot鉴定GFP具体表达量的对比,观察到pBS/U6-60,pBS/U6-260对pEGFP-N1-ORF7的表达有明显的抑制作用,并用RT-PCR确定表达产物为目的产物,证明本实验中干扰载体的高度特异性。定量分析Western-blot条带,结果表明pBS/U6-60,pBS/U6-260对N基因的干扰效果分别为82.90%和69.95%。根据实验结果可以看出,RNAi可以对PRRSV N基因的表达产生干扰作用,提出所选取的靶位点可能是两个对PRRSV全病毒复制起抑制作用的潜在位点。 转染pEGFP-N1荧光载体进入MARC-145细胞系,摸索真核表达载体在MARC-145细胞中高效表达的条件,为RNA干扰载体在MARC-145细胞中成功执行生物学功能做铺垫。设定不同的PRRSV病毒接毒量和不同的接毒时间,将干扰载体pBS/U6-60和pBS/U6-260以及对照载体pBS/U6-Neg转染进入宿主细胞MARC-145中,成功检测到pBS/U6-60和pBS/U6-260在MARC-145细胞中对PRRSV病毒增殖的抑制现象。选取转染前后不同时间段的病毒上清做病毒TCID50测定,观察CPE并利用IFA检测,得到pBS/U6-60和pBS/U6-260抑制PRRSV VR2332 resp株增殖作用的动态数据,显示RNA干扰技术可以在72到120小时显著抑制PRRSV的繁殖,在预防和治疗上都有显著效果。选取接毒后72小时,对病毒中N基因的表达情况进行Western-blot鉴定,结果显示,pBS/U6-60干扰PRRSV VR2332 Resp株N基因表达的效率可以达到70.15%。最终,（Ⅰ）证实在真核细胞水平上,可以利用RNA干扰机制抑制PRRSV VR2332 resp株的增殖:（Ⅱ）提出在所选PRRSV VR2332 resp株N基因的两处靶位点序列中,存在病毒复制的关键性作用位点的观点;（Ⅲ）为日后新型PRRSV疫苗设计打下一定的理论基础。
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