厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及其代谢与菌群变化的研究

论文摘要

甲烷是瘤胃微生物代谢的终产物之一,它的产生既损失能量,又增加温室气体负荷,因此瘤胃产甲烷菌的研究越来越受到重视。本论文报告了来自瘤胃内容物的混合厌氧真菌与产甲烷菌在产甲烷过程中的相互关系。首先建立了瘤胃产甲烷菌DGGE分析方法；通过体外连续传代培养获得厌氧真菌与产甲烷菌的共培养物,研究产甲烷菌对厌氧真菌代谢的影响,厌氧真菌活力对甲烷菌甲烷产生能力的影响及传代过程中真菌与产甲烷菌菌群的变化；最后,分离培养相关瘤胃厌氧真菌与产甲烷菌。试验共分为4部分：1瘤胃古菌DGGE分子生态学研究方法的建立本试验建立了瘤胃古菌16S rRNA基因的DGGE分析方法。首先利用瘤胃液总DNA及细菌DNA,比较了10对用于古菌16S rRNA基因DGGE分析的PCR引物。其中6对为直接PCR扩增引物,4对巢式PCR扩增引物。经过PCR初步筛选,确定三对直接PCR扩增引物（519f/915rGC,1106fGC/1378r和344fGC/915r）可用于瘤胃古菌的DGGE分析。引物519f/915rGC和1106fGC/1378r得到了条带清晰的DGGE电泳图谱,从图谱中分别获得33个和6个条带,而引物344fGC/915r的DGGE图谱中只得到一条电泳条带。将所有DGGE图谱中的条带切胶回收核酸,克隆,测序。所有条带都属于产甲烷菌16S rRNA基因序列。结果显示,引物519f/915rGC能扩增瘤胃液得到较好的PCR产物,该产物用于DGGE电泳,获得条带清晰的电泳图谱,测序结果表明,DGGE胶上的条带属于甲烷短杆菌及一类未培养产甲烷菌,该引物较适合用于瘤胃古菌的DGGE分析。2瘤胃厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及菌群多样性分析根据瘤胃微生物对抗生素的敏感性,用青霉素和链霉素抑制细菌生长,通过体外分离培养方法获得厌氧真菌与产甲烷菌共培养液。对共培养传代62次,取第5、15、25、35、45、55、62代共培养液样品进行分析,研究该共培养液中厌氧真菌与产甲烷菌的种类及多样性变化。结果显示：瘤胃液中厌氧真菌复杂多样,ARISA图谱中共出现13个峰；但在厌氧真菌与产甲烷菌的共培养液中,厌氧真菌多样性降低,从第5代至62代,ARISA图谱相似,只出现3个峰；这些厌氧真菌在共培养液传代过程中一直稳定存在。瘤胃液中的产甲烷菌复杂多样,DGGE图谱中共出现17个条带；共培养液中,产甲烷菌多样性降低,但与厌氧真菌相比较为复杂；随着共培养液的传代培养,产甲烷菌多样性逐渐降低,到第62代时,产甲烷菌DGGE图谱中仅有2个条带。对第25代共培养液中的产甲烷菌进行克隆测序,共得到13个不同的16S rRNA基因序列,其中12个与甲烷短杆菌相似,剩下的一个基因序列与现有的甲烷菌序列相似性低于80%,可能属于甲烷菌的一个新的目。根据该新的可培养未知产甲烷菌16SrDNA序列的特征,设计了一对特异性引物扩增该产甲烷菌,并对PCR扩增条件进行了优化,建立了该产甲烷菌的PCR检测方法。综上所述：本研究建立了厌氧真菌与产甲烷菌体外共培养体系,并分析了共培养体系中的菌群多样性,与瘤胃液相比,共培养系统中厌氧真菌菌群较为简单,共培养体系中的产甲烷菌主要是甲烷短杆菌和一类可培养的未知产甲烷菌,进而建立了该可培养未知产甲烷菌的PCR检测方法。3厌氧真菌活力及传代频率对真菌与产甲烷菌共培养液的影响厌氧真菌体外传代培养时,其活力受每代生长时间（即传代频率）的影响。本试验从瘤胃中获得厌氧真菌与产甲烷菌共培养液,以不同的传代频率（3d/代,5d/代,7d/代）进行连续传代培养,共传代9次,测定不同传代频率下,共培养液的发酵产气量、代谢产物、厌氧真菌多样性、产甲烷菌多样性及检测新的可培养未知产甲烷菌。结果显示：三种不同传代频率的共培养液中,只有少量乳酸（基本低于1.5mM）、甲酸（低于0.1mM）、丙酸、丁酸和戊酸存在；各培养液pH值差异不显著（处于6.5±0.2范围內）；5d和7d传代的共培养液的总产气量（高于200mL）显著高于3d传代的共培养液（低于150mL）；在7d传代的共培养液中,其24-72h的平均产气量呈现明显的波动；7d传代的共培养液中甲烷产量显著高于3d和5d传代的共培养液；共培养液在传代过程中厌氧真菌的多样性逐渐降低,到第9代时趋于稳定,此时5d和7d传代的共培养液中厌氧真菌的种类与3d传代的共培养液不同；在共培养液的整个传代过程中产甲烷菌菌群一直维持复杂多样,没有明显的变化规律,并且本试验所用的两种内切酶MspⅠ和TaqⅠ所得的结果有所差别；到第9代时,在3d传代的共培养液中不能检测到新的可培养未知甲烷菌,在5d和7d传代的共培养液中能检测到该菌。与纯的真菌培养液相比,所有共培养液的产气量显著提高；乙酸产量显著提高；甲酸和乳酸浓度显著降低；并且共培养液中真菌的多样性高于纯的真菌培养液,即在没有产甲烷菌存在的情况下,真菌的多样性也有所降低。综上所述,本研究探讨了厌氧真菌活力及传代频率对真菌与产甲烷菌共培养系统菌群及代谢的影响,随着传代次数增加,共培养体系中厌氧真菌与产甲烷菌菌群数量降低,共培养体系中的微生物菌群受传代频率的影响；传代频率降低（间隔时间长）,共培养体系中的代谢产物累积增加。与纯真菌培养液相比,共培养体系能维持较高的菌群多样性,能减少共培养体系中代谢产物的积累。4瘤胃产甲烷菌与厌氧真菌的分离培养本研究利用Hungate滚管法对瘤胃产甲烷菌及厌氧真菌进行了分离培养,并对产甲烷菌进行了16SrRNA基因序列的测序鉴定,对厌氧真菌进行了ARISA分析。共得产甲烷菌4株,分别属于Methanobacterium beijingense, Methanobacterium formicicum, Methanoculleus sp., Methanosarcina mazei,其中首次从瘤胃内分离培养到Methanobacterium beijingense;得到厌氧真菌6株,它们分别属于Caecomyces属和Neocallimastix属,对这6株真菌的ARISA分析结果表明,其中5株真菌的ARISA图谱相似,可能属于同一种真菌。结论：本研究共分离培养到4株产甲烷菌和6株厌氧真菌,并首次从瘤胃内分离培养到产甲烷菌Methanobacterium beijingense菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 单位符号缩写
• 前言
• 文献综述
• 第一章 瘤胃中甲烷的生成及其相关微生物
• 1 甲烷的生成过程
• 2 瘤胃内与甲烷产生相关的微生物
• 第二章 厌氧真菌的生态作用及其研究进展
• 1 厌氧真菌简介
• 2 瘤胃内厌氧真菌的作用
• 3 瘤胃厌氧真菌的分类
• 4 利用分子生物学技术研究瘤胃厌氧真菌
• 5 瘤胃厌氧真菌研究前景
• 第三章 瘤胃产甲烷菌的生态作用及其研究进展
• 1 产甲烷菌的分布及作用
• 2 产甲烷菌的分类历史与分类手段
• 3 利用分子生物学技术研究瘤胃产甲烷菌
• 4 产甲烷菌研究前景
• 试验部分
• 第四章 瘤胃古菌DGGE分子生态学研究方法的建立
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 英文摘要
• 第五章 瘤胃厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及菌群多样性分析
• 摘要
• 第一节 厌氧真菌ARISA方法的建立及其对共培养中真菌多样性的分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第二节 共培养系统中产甲烷菌的多样性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第三节 新的可培养产甲烷菌特异性引物的设计及该菌PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 英文摘要
• 第六章 厌氧真菌活力及传代频率对真菌与产甲烷菌混合培养液的影响
• 摘要
• 第一节 共培养液在连续传代过程中产气量及甲烷产量的测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第二节 共培养液在连续传代过程中发酵产物的测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第三节 共培养液在连续传代过程中厌氧真菌多样性的变化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第四节 共培养液在连续传代过程中产甲烷菌多样性的变化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第五节 共培养液在连续传代过程中新的产甲烷菌的变化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 英文摘要
• 第七章 瘤胃厌氧真菌与产甲烷菌的分离培养
• 摘要
• 第一节 瘤胃内产甲烷菌的分离培养
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 第二节 瘤胃厌氧真菌的分离培养
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 英文摘要
• 全文结论及创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文