猪圆环病毒2型和细小病毒共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫功能的影响

论文摘要

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起猪断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合症等猪圆环病毒病（PCVD）的病原,而猪细小病毒（PPV）是PCVD发病的重要协同致病因子。已知猪肺泡巨噬细胞（PAM）既是PCV2与PPV的主要靶细胞,又是重要的免疫细胞。本研究通过分析PCV2与PPV共感染健康仔猪的PAM吞噬功能、细胞因子和重要抗原递呈相关分子表达水平动态变化,从细胞与分子水平探讨PCV2与PPV共感染对猪PAM免疫功能的影响。应用RT-PCR技术,从猪PAM中分别扩增并克隆了猪抗原递呈功能相关分子CD80、CD86和细胞因子IL-1β、IFN-α1、TNF-α等及管家基因β-actin的部分基因片段,构建了相应分子的阳性重组质粒,建立了检测上述各种分子的实时荧光定量PCR（Real-time FQ-PCR）的标准曲线及其直线回归方程,确定了其最适反应条件。将48头35日龄的健康仔猪分为PCV2单独感染组、PPV单独感染组、PCV2/PPV共感染组和空白对照组4组,12头/组。分别于感染后第3、7、14、35 d随机剖杀3头,收集PAM。通过台盼蓝染色和鸡红细胞吞噬试验,分别检测了感染后不同时间PAM的存活率和吞噬功能的动态变化。结果表明,感染后整体上PCV2/PPV共感染组PAM的存活率与PCV2单独感染组的差异不显著,但共感染组PAM的吞噬活性显著低于PCV2和PPV单独感染组。应用Real-time FQ-PCR测定了感染后不同时相PAM表达的促炎细胞因子、趋化细胞因子和调节细胞因子mRNA水平。结果显示,PCV2/PPV共感染导致促炎细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA转录水平在感染早期显著上升（P<0.01）,IFN-α1的表达水平出现持续抑制,但IL-6的水平上调;导致趋化因子IL-8表达量持续降低,MCP-1与MIP-1β含量在感染早期显著升高,后期显著降低（P<0.05）;引起调节细胞因子IL-10表达水平早期突然升高（P<0.01）,IL-12p40的表达水平在14DPI时显著上升,而IFN-γ、IL-18与GM-CSF的表达持续受到抑制。综合分析上述细胞因子的表达动态表明,PCV2/PPV共感染可以加重局部的急性炎症反应,导致机体早期抗病毒能力和趋化功能降低,使机体的免疫调节机能出现抑制和紊乱。应用流式细胞术和Real-time FQ-PCR,分别检测了感染后不同时相PAM表达SLA-1类分子、SLA-DR分子及CD80、CD86 mRNA的含量,结果显示:PCV2/PPV共感染组在35 DPI时SLA-1含量显著下调（P<0.01）,7 DPI时SLA-DR含量低于PCV2单独感染组的表达水平（P<0.05）。CD80和CD86 mRNA的转录水平在35 DPI时均显著低于PCV2感染组。此结果表明,PCV2/PPV共感染初期引起外源性抗原递呈功能的严重抑制,感染后期主要引起内源性抗原递呈功能的显著降低。综合上述研究结果表明,PCV2/PPV共感染对PAM的存活率影响不明显,但是能够显著降低PAM的吞噬能力,加重局部的急性炎症反应,导致机体早期抗病毒能力和趋化功能降低,使机体的免疫调节机能和抗原递呈功能出现抑制,PPV在PCV2对PAM的免疫致病过程中起到了重要的协同作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 猪圆环病毒2 型的国内外研究概况
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 PCV2 致病机制
• 1.1.4 PCV2 的诊断
• 1.1.5 PCV2 的防治
• 1.2 研究内容和技术路线
• 1.2.1 研究内容
• 1.2.2 技术路线（见下页）
• 1.3 研究目的与意义
• 1.4 研究目标
• 2 材料
• 2.1 毒株
• 2.2 菌株和载体
• 2.3 实验动物
• 2.4 主要试剂
• 2.4.1 RNA 和DNA 提取试剂
• 2.4.2 细胞培养用溶液
• 2.4.3 试剂
• 2.4.4 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液
• 2.4.5 质粒DNA 提取用溶液
• 2.4.6 琼脂糖凝胶电泳用溶液
• 2.4.7 流式细胞术（FCM）检测用标记抗体
• 2.5 主要仪器
• 3 方法
• 3.1 PCR 用引物的设计与合成
• 3.2 PAM 抗原递呈功能相关分子、细胞因子和PCV2、PPV 的相关基因片段的重组质粒的构建
• 3.2.1 肺泡巨噬细胞的收集
• 3.2.2 肺泡巨噬细胞总RNA 的提取
• 3.2.3 PCV2 与PPV DNA 的提取
• 3.2.4 共刺激分子和细胞因子及 PCV2、PPV 的部分基因片段重组质粒的构建
• 3.3 动物实验
• 3.3.1 试验动物分组与感染
• 3.3.2 PCV2 与PPV 抗体检测
• 3.3.3 PAM 活性检测
• 3.3.4 病毒、细胞因子和CD 分子标准曲线的建立
• 3.3.5 PAM 中PCV2、PPV 病毒载量的检测
• 3.3.6 PAM 细胞因子表达水平的检测
• 3.3.7 PAM 主要抗原递呈相关分子的检测
• 3.3.8 数据表示和统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 PAM 共刺激分子、细胞因子和PCV2、PPV 目的基因片段重组质粒的鉴定
• 4.2 PAM 共刺激分子、细胞因子和PCV2、PPV 目的基因片段标准曲线的建立
• 4.3 血清中PCV2 和PPV 抗体检测
• 4.4 PAM 中PCV2 与PPV 的含量
• 4.4.1 PAM 中PCV2 核酸的含量
• 4.4.2 PAM 中PPV 核酸的含量
• 4.5 PCV2/PPV 共感染对PAM 存活率与吞噬功能的影响
• 4.5.1 PCV2/PPV 共感染对PAM 存活率的影响
• 4.5.2 PCV2/PPV 共感染对PAM 吞噬功能的影响
• 4.6 PCV2/PPV 共感染对PAM 中细胞因子表达水平的影响
• 4.6.1 病毒感染猪PAM 表达促炎细胞因子水平的变化
• 4.6.2 病毒感染猪PAM 表达趋化细胞因子水平的变化
• 4.6.3 病毒感染猪PAM 表达调节细胞因子的水平变化
• 4.7 PAM 抗原递呈相关分子表达水平的变化
• 4.7.1 PAM 表面SLA-1 和SLA-DR 分子含量的动态变化
• 4.7.2 PAM 中共刺激分子CD80 mRNA 和CD86 mRNA 的动态变化
• 5 讨论
• 5.1 Real-time FQ-PCR 标准曲线的建立
• 5.1.1 管家基因的确定
• 5.1.2 定量方法的确定
• 5.1.3 Real-time FQ-PCR 存在的问题
• 5.2 PAM 活性和吞噬功能动态
• 5.3 PAM 表达抗原递呈功能相关分子和细胞因子的动态
• 5.3.1 PCV2 和PPV 共感染对PAM 促炎细胞因子mRNA 水平的影响
• 5.3.2 PCV2 和PPV 共感染对PAM 趋化细胞因子mRNA 水平的影响
• 5.3.3 PCV2 和PPV 共感染对PAM 调节细胞因子mRNA 水平的影响
• 5.3.4 PAM 表面SLA-1 和SLA-DR 类分子含量的动态变化
• 5.3.5 PAM 中共刺激分子CD80 mRNA 和CD86 mRNA 的动态变化
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文与获得的研究成果
• 作者简介
• 致谢