论文摘要
MSCs是成体干细胞之一,具有多项分化潜能,在体外可被多种诱导剂诱导分化为神经元和胶质细胞。MSCs具有取材方便、增殖能力强、可自体移植、安全、无免疫排斥及符合人文伦理要求等众多自身优势。因此,MSCs可成为细胞移植治疗中枢神经系统损伤和变性疾病理想的种子细胞。但是目前技术难以通过体外诱导分化得到足够的神经细胞数量而限制了其应用。深入研究、阐明MSCs定向诱导分化机制是解决这一问题的关键。Sonic hedgehog（Shh）信号通路由Shh、Ptc、Smo及下游的锌指转录因子Gli蛋白等组成。当不存在Shh时,Ptc抑制Smo的活性,从而抑制目标基因的表达;当Shh与Ptc结合时,Smo上的抑制效应被解除,激活状态的Smo引起Gli蛋白进入细胞核,诱导目标基因表达。在多细胞生物胚胎发育过程中,Shh信号通路参与调控细胞的增殖、分化。目前Shh信号通路是否参与MSCs增殖、分化的调控未见文献报道。因此本实验研究Shh信号通路是否参与MSCs诱导分化为神经细胞的调控。第一部分实验采用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠MSCs,并对其生物学特性进行研究。得到如下结果:培养的第3代MSCs,细胞增殖能力已趋于稳定,骨髓基质细胞表面标志CD54、CD44阳性的细胞已达到95.18%、94.36%。造血干细胞表面标志CD14阳性的细胞已从原代的23.19%降低到2.37%。表明第3代以后的细胞已适合于细胞诱导分化,可作为理想细胞移植治疗的细胞来源。第二部分实验采用形态学、免疫荧光、Western Blot法观察bFGF和EGF联合诱导MSCs向神经细胞分化的效果。得到如下结果:1、bFGF、EGF联合诱导培养MSCs5天,可见大的悬浮神经球样细胞团块。由原代球状细胞团块分离出的单个细胞继续培养,可增殖形成次代球状细胞团块。加入分化液培养数小时后,可见细胞从球体中迁移到边缘,伸出突起。第5天时,可见细胞迁移形成网络样结构,细胞形态多样,具有一个或多个突起,部份细胞有生长锥样形态。2、免疫荧光发现球状细胞团块呈Nestin阳性,而β-III Tubulin、NSE、MAP-2、GFAP、GC均为阴性。球状细胞团块加入分化液培养后,随培养时间的延长,Nestin阳性细胞逐渐减少,而β-III Tubulin、NSE、MAP-2、GFAP、GC阳性细胞逐渐增多。分化培养第5天时,15-55%的细胞β-III Tubulin、NSE、MAP-2阳性。NSE阳性细胞的胞体小,有一或二个长的突起,部分细胞有一生长锥样结构。3、Western Blot分析显示:球状细胞团块在加入分化液培养前,可见Nestin蛋白强表达,β-III Tubulin、NSE蛋白弱表达,MAP-2、GFAP蛋白无表达。分化培养1天时,Nestin、β-III Tubulin表达强,NSE、MAP-2、GFAP有表达。分化培养5天时,Nestin、β-III Tubulin表达减弱,NSE、MAP-2、GFAP表达增强。结果表明bFGF、EGF联合诱导MSCs可有效形成神经球。这些神经球能扩增并分化为神经元、胶质细胞、少突胶质细胞。第三部分实验采用免疫荧光、Western Blot、RT-PCR检测Shh及相关信号分子在MSCs中的表达。得到如下结果:MSCs有较强的Shh、Ptc1、Gli-1 mRNA和蛋白的表达。结果表明Shh信号通路存在于MSCs中。第四部分实验采用免疫荧光、Western Blot、定量real-time PCR检测体外诱导MSCs分化为神经细胞对Shh信号通路的影响。得到如下结果:1、诱导组Shh、Ptc、Gli-1、Nestin、NSEmRNA的表达较对照组增强（P<0.01, P<0.05）。2、免疫荧光发现对照组MSCs Gli-1蛋白表达于胞浆,而诱导组Gli-1蛋白表达于胞核,提示Gli-1蛋白发生了核移位。3、Western Blot法显示,诱导前MSCs有Shh、Ptc、Gli-1、Nestin、NSE蛋白的表达,诱导后Shh、Ptc、Gli-1、Nestin、NSE蛋白表达较诱导前增加（P<0.01）。诱导后胞浆Gli-1蛋白较诱导前降低,而胞核Gli-1蛋白较诱导前升高（P<0.01,P<0.05）。结果表明诱导MSCs分化为神经细胞时Shh信号通路被激活。第五部分实验采用Western Blot、定量real-time PCR观察外源性Shh及抑制剂环王巴明对MSCs分化的影响。得到如下结果:1.MSCs经诱导培养48小时,诱导组、溶剂对照组Nestin mRNA的表达较正常组明显增加（P<0.01）。Shh组、Cyclopamine组Nestin mRNA的表达较诱导组明显降低（P<0.01）。而Cyclopamine组Nestin mRNA的表达较Shh组的高（P<0.05）。2.MSCs经诱导培养48小时,诱导组、Shh组、溶剂对照组NSE mRNA的表达较正常组明显增加（P<0.01）;Cyclopamine组NSE的表达也较正常组高（P<0.05）。Shh组较诱导组明显增高（P<0.01）;Cyclopamine组较诱导组明显降低（P<0.01）;Cyclopamine组的表达明显低于Shh组（P<0.01）。3.MSCs经诱导培养48小时,诱导组、Cyclopamine组、溶剂对照组Nestin蛋白的表达较正常组明显增加（P<0.01）;Shh组与正常组比较无差异。Shh组、Cyclopamine组较诱导组的表达明显降低（P<0.01）。而Cyclopamine组的表达较Shh组高（P<0.01）。4.MSCs经诱导培养48小时,诱导组、Shh组NSE蛋白的表达较正常组明显增加（P <0.01）;溶剂对照组较正常组高（P <0.05）。Cyclopamine组与正常组比较无显著性差异。Shh组的表达明显较诱导组增高（P<0.01）;Cyclopamine组的表达明显较诱导组降低,（P<0.01）;Cyclopamine组的表达明显低于Shh组（P<0.01）。结果表明MSCs经诱导培养48小时,有Nestin、NSE mRNA和蛋白的表达;Shh促进MSCs向神经细胞的分化,而Cyclopamine则起抑制作用。第六部分实验采用CCK-8法测定细胞活力,并测LDH、MDA、GSH、NO、SOD的含量,观察Shh信号通路对定向诱导的MSCs抗氧化损伤作用的影响。得到如下结果:1.MSCs缺血缺氧后各组细胞活力均较正常对照组及诱导组减弱（P<0.05）;在Shh组,可见细胞活力较正常缺血组及诱导缺血组增强（P<0.05）;Cyclopamine组细胞活力明显较正常缺血组及诱导缺血组减弱（P<0.05）。证实Shh能保护细胞拮抗缺血缺氧损伤,而Cyclopamine能减弱Shh对细胞的保护作用。2.正常缺血组、诱导缺血组、溶剂组、Cyclopamine组NO、LDH释放率（%）、GSH、MDA、SOD均较正常对照组及诱导组增加（P<0.01）。Shh组NO、LDH释放率（%）、MDA与正常对照组及诱导组无显著性差异（P﹥0.01）,而较正常缺血组显著降低（P<0.01）;Shh组GSH、SOD较各组增高（P<0.01）,表明Shh能抑制细胞释放NO、LDH、MDA,促进细胞释放GSH、SOD。Cyclopamine组NO、LDH释放率（%）、MDA的增加更为显著,而GSH、SOD的增加不显著,表明Cyclopamine能促进细胞释放NO、LDH、MDA,抑制细胞释放GSH、SOD。结果表明在诱导MSCs分化的同时缺血缺氧,激活Shh信号通路可减轻氧自由基对诱导细胞的损害从而增强细胞活力;抑制Shh信号通路则氧自由基对细胞的损害增加从而削弱细胞活力。