论文摘要
肿瘤血管靶向性的抗肿瘤治疗，日益受到人们的关注。Endostatin是目前比较看好的一种内源性抗血管生成的抑制因子。大量的研究数据表明它在体内体外实验中，具有很强的抑制内皮细胞增殖和迁移的作用，最近的研究表明带有P125A的endostatin有更强的黏附血管内皮细胞的能力，而且有更高的抑制内皮细胞增殖和迁移的效率。目的：评价和比较外源野生型内皮抑素（wild endostatin，wES）和突变型内皮抑素（mutant endostatin，mES；P125A）抑制内皮细胞增殖和迁移的效率，为人源基因载体开展肿瘤的血管靶向基因治疗提供实验依据。方法：PCR定点诱变法获取mES（P125A）；构建pcDNA3.1／wES和pcDNA3.1／mES载体，瞬时转染Bel-7402肝癌细胞系，利用ELISA检测wES和rnES的表达情况；筛选和建立稳定转染Bel-7402肝癌细胞株，收集含有ES的细胞上清培养液作为HUVEC的条件培养基，MTT试验和流式细胞仪检测wES和mES对HUVEC的增殖和凋亡的影响。构建携带EF-1α启动子的分泌型重组体phrneo／mES，电转Bel-7402细胞，G418筛选和RT-PCR鉴定稳定表达克隆，ELISA检测mES的表达情况。结果：测序结果显示获得了包含全长的mES（P125A），共624bp；构建的pcDNA3.1／wES和pcDNA3.1／mES瞬时转染bel-7402肝癌细胞24小时后的ES次表达量分别为18.57±2.39 ng／ml和17.78±2.74ng／ml，无显著性差异；稳定克隆培养上清液能获得的102ng／ml级的ES，500ng／ml的wES和mES对于HUVEC增殖的抑制率分别为41.4％和64.0％，诱导凋亡的效率分别为13.0％和32.7％，均有显著性差异。成功构建的phrneo／mES，获得了24个稳定转染克隆，mES表达量为15-20ng╱106细胞／24h。结论：（1）获得了P125A突变型ES；（2）wES和mES在瞬时转染的Bel-7402肝癌细胞中表达量无显著差异；（3）获得了ES稳定表达Bel-7402肝癌细胞株，能表达较高浓度的ES；（4）在体外，mES比wES有更强的抑制HUVEC增殖的作用和诱导HUVEC凋亡的能力；（5）成功构建了phrneo／mES，稳定转染Bel-7402肝癌细胞株后可表达mES。
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标签：内皮抑素论文; 人源基因打靶载体论文; 细胞转染论文; 肝癌细胞论文; 人脐静脉内皮细胞论文;