麦红吸浆虫滞育的生理生化机制研究

论文摘要

麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana（Gehin）是小麦生产中间歇性猖獗成灾的毁灭性害虫。在我国20世纪50和80年代曾两次大面积暴发成灾，损失惨重。近年来，麦红吸浆虫在我国大范围猖獗成灾的势头得到了有效的遏制，但局部地区大发生的现象仍时有发生，并具有扩散蔓延的趋势，对小麦生产的威胁并未解除。多年来的研究表明，滞育是引起其猖獗成灾的主要原因之一，但有关麦红吸浆虫的滞育机理，有许多问题至今仍不清楚。本文在前人研究工作的基础上，采用生物化学、蛋白质组学、放射免疫分析和电镜技术等多学科交叉的前沿方法和手段，继续对麦红吸浆虫滞育机理进行深入细致的研究，取得了一定的新进展，为今后进一步深入研究其滞育机理、成灾规律、预测预报、大面积综合治理奠定了良好的基础。主要研究结果如下：1．应用考马斯亮蓝G-250染色法、SDS-PAGE及PAGE电泳技术分析了麦红吸浆虫滞育前后及滞育期蛋白质含量和组分的变化。结果表明，不同阶段蛋白质含量存在显著差异，老熟幼虫入土前和滞育解除后均高于入土滞育期。入土滞育期间，同期裸露幼虫与结茧幼虫，以及不同滞育年限幼虫的蛋白质含量差异均不显著；滞育年周期中，无论结茧幼虫还是裸露幼虫，蛋白质含量的变化均可划分为两个阶段，第1阶段为当年6月至12月，蛋白质含量较低，平均为19．2269μg／头和19．5734μg／头；第2阶段为翌年2月底至5月中旬，蛋白质含量相对较高，平均为20．9578μg／头和20．7153μg／头。电泳图谱分析发现，SDS-PAGE 18．3kD和32．0kD蛋白带与4条PAGE蛋白带的表达量，以及SDS-PAGE 18．3kD和19．8kD蛋白带的相对表达量在滞育前后及滞育期发生了一定的变化，但在滞育期不同阶段基本无变化。2．应用蛋白质双向电泳和质谱分析技术对麦红吸浆虫幼虫滞育前、越夏和越冬滞育期及滞育解除后4个阶段蛋白质组的表达进行了研究。结果表明，在考马斯亮蓝染色的双向电泳pH3-10胶上，PDQuest 7．4软件可识别滞育前幼虫蛋白点约300个，其它时期约275个。以滞育前幼虫为参照，越夏、越冬滞育期及滞育解除后幼虫蛋白表达量差异达2倍以上的点分别有91个、92个和95个。对3个在滞育前高表达或特异表达、2个滞育前低表达或缺失、1个冬季滞育期特异表达、2个夏季和冬季滞育期高表达的8个差异显著的斑点进行质谱测定，均获得肽质量指纹图谱，搜索NCBInr数据库初步鉴定出7个蛋白质，它们分别是阿片黑素促皮质素原，NADH脱氢酶亚基1，F10F2．5，IKK相互作用蛋白同型2，GA10647-PA，紫色CG16784-PB同型B和B0228-6，这些蛋白质在麦红吸浆虫滞育过程中发挥着重要作用。3．用保护酶活性测试盒分别测定了麦红吸浆虫滞育前后及滞育期过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等3种保护酶的活力。结果表明，幼虫从老熟到进入滞育的初期，3种保护酶的活力均呈下降趋势。滞育年周期中，SOD和CAT活力对环境温度的反应相同，即低温促进其活力升高，高温导致其活力下降；POD活力与环境温度和滞育发育有关；整个滞育期，裸露幼虫和结茧幼虫3种保护酶的活力随季节变化趋势相同，但同期的裸露幼虫活力略高于结茧幼虫；不同滞育年限幼虫3种保护酶的活力差异不显著。滞育解除后，3种保护酶的活力均随着生长发育进程逐渐升高。4．用代谢酶活性测试盒分别测定了麦红吸浆虫滞育前后和滞育期糖原磷酸化酶（Gpase）、磷酸果糖激酶（PFK）、己糖激酶（HK）和醛缩酶（ALD）等4种代谢酶活力的变化。结果表明，麦红吸浆虫滞育前后代谢酶活力明显不同，滞育后Gpase活力显著提高，糖酵解有关酶PFK、HK和ALD活力降低，以保证更多的糖原转化为海藻糖；滞育解除后Gpase活力降低，PFK、HK和ALD活力升高，以确保昆虫生长发育所需的物质和能量供给。滞育期间，4种代谢酶的活力均与滞育发育有关；同时Gpase和PFK的活力也与环境温度有关，即夏、冬季高于春、秋季；同期不同滞育状态幼虫比较，裸露幼虫PFK、HK和ALD活力总是略高于结茧幼虫，Gpase则相反。同一时期不同滞育年限幼虫4种代谢酶的活力无显著差异。5．用放射免疫分析法测定了麦红吸浆虫滞育前后及滞育期全虫体内蜕皮甾类激素滴度的变化。结果表明，入土滞育过程中，同期裸露幼虫与结茧幼虫，以及不同滞育年限幼虫的蜕皮甾类激素滴度差异均不显著。在年发生周期中，滞育前后及滞育期蜕皮甾类激素呈现出明显的动态变化，入土进入滞育后显著降低，入土滞育期间，11月5日以前及二次滞育幼虫较低，且变化幅度较小；冬季寒冷季节蜕皮甾类激素最高，为7．0pg／幼虫左右。滞育解除后蜕皮甾类激素滴度显著降低，之后随着幼虫的生长发育逐渐升高，至化蛹前一周左右达到最高峰，为15．22pg／幼虫。6．应用电镜技术，对麦红吸浆虫麦穗老熟幼虫和滞育圆茧丝腺细胞进行了超微结构观察。结果发现麦穗老熟幼虫和结茧幼虫丝腺胞质中均分布有发达平行排列的粗面内质网、高尔基体和线粒体。但麦穗老熟幼虫胞质中还分布有发达的环形粗面内质网，高尔基体周围电子致密度高，糖原颗粒含量丰富，腺腔中充满了电子致密度高的丝物质；相反，结茧幼虫高尔基体周围电子致密度低，糖原颗粒含量极微，腺腔丝物质含量低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 昆虫滞育研究进展
• 1.1.1 昆虫滞育的个体生态学研究
• 1.1.2 昆虫滞育的环境生态学研究
• 1.1.3 昆虫滞育的组织结构变化
• 1.1.4 昆虫滞育的生理生化研究
• 1.1.5 昆虫滞育的内分泌学研究
• 1.1.6 分子生物学技术在昆虫滞育研究中的应用
• 1.2 蛋白质组学技术及其在昆虫研究中的应用
• 1.2.1 蛋白质组学研究的技术路线
• 1.2.2 蛋白质组学研究的主要技术
• 1.2.3 蛋白质组学在昆虫研究中的应用
• 1.3 麦红吸浆虫滞育研究回顾及现状
• 1.3.1 麦红吸浆虫的滞育特点
• 1.3.2 麦红吸浆虫滞育研究概况
• 1.4 选题依据、目的及意义
• 第二章 麦红吸浆虫滞育前后和滞育期蛋白质含量及其电泳分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试虫源
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白质提取
• 2.2.2 蛋白质含量测定
• 2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.4 聚丙烯酞胺凝胶电泳
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 麦红吸浆虫滞育不同阶段蛋白质含量变化
• 2.3.2 麦红吸浆虫滞育期间蛋白质含量变化
• 2.3.3 滞育前后及滞育期 SDS-PAGE电泳图谱分析
• 2.3.4 滞育前后及滞育期PAGE电泳图谱分析
• 2.4 讨论
• 第三章 麦红吸浆虫幼虫滞育不同时期蛋白质组学研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试虫源
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要溶液的配制
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蛋白质的提取和制备
• 3.2.2 双向电泳样品制备
• 3.2.3 双向凝胶电泳
• 3.2.4 考马斯亮蓝染色、脱色
• 3.2.5 凝胶成像及图象分析
• 3.2.6 蛋白质点胶内酶切及质谱分析
• 3.2.7 数据库查询和蛋白鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 麦红吸浆虫幼虫滞育不同时期蛋白质双向电泳图谱
• 3.3.2 不同时斯蛋白质谱表达差异的分析
• 3.3.3 差异蛋白的MALDI-TOF-MS分析
• 3.3.4 差异蛋白的PMF鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 麦红吸浆虫滞育发生和解除过程中保护酶活力动态
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 试虫来源
• 4.1.2 实验试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酶液制备
• 4.2.2 酶活力测定
• 4.2.3 数据分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 滞育年周期中3种保护酶活力动态
• 4.3.2 不同滞育状态下3种保护酶活力比较
• 4.3.3 不同滞育年限幼虫3种保护酶活力比较
• 4.3.4 滞育解除后3种保护酶活性的变化
• 4.4 讨论
• 第五章 麦红吸桨虫滞育前后和滞育期代谢酶活力分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试虫来源
• 5.1.2 实验试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 酶液制备
• 5.2.2 酶活力测定
• 5.2.3 数据分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 滞育前后及滞育年周期中4种代谢酶活力变化
• 5.3.2 不同滞育状态4种代谢酶活力比较
• 5.3.3 不同滞育年限幼虫4种代谢酶酶活力比较
• 5.4 讨论
• 第六章 麦红吸浆虫滞育前后和滞育期蜕皮甾类激素滴度的动态变化
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 供试虫源
• 6.1.2 主要试剂及其配制
• 6.1.3 主要仪器设备
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 蜕皮甾类激素的抽提
• 6.2.2 蜕皮甾类激素滴度的测定
• 6.2.3 数据处理与分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 麦红吸浆虫滞育前后及滞育期蜕皮甾类激素滴度变化
• 6.3.2 不同滞育状态蜕皮甾类激素滴度比较
• 6.3.3 不同滞育年限蜕皮甾类激素滴度比较
• 6.4 讨论
• 第七章 麦红吸浆虫滞育与非滞育幼虫丝腺超微结构观察
• 7.1 实验材料
• 7.1.1 样品的采集与保存
• 7.1.2 主要试剂
• 7.1.3 主要溶液的配制
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 丝腺剖取
• 7.2.2 丝腺超微结构观察
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 内质网
• 7.3.2 脂滴和糖原颗粒
• 7.3.3 高尔基体周围分泌颗粒
• 7.3.4 腺腔
• 7.4 讨论
• 第八章 总结
• 8.1 主要结论
• 8.1.1 麦红吸浆虫滞育前后和滞育期蛋白质含量及其电泳分析
• 8.1.2 麦红吸浆虫幼虫滞育不同时期蛋白质组学研究
• 8.1.3 麦红吸浆虫滞育发生和解除过程中保护酶活力动态
• 8.1.4 麦红吸浆虫滞育前后和滞育期代谢酶活力分析
• 8.1.5 麦红吸浆虫滞育前后和滞育期蜕皮激素滴度的动态变化
• 8.1.6 麦红吸浆虫滞育与非滞育幼虫丝腺超微结构观察
• 8.2 存在的问题及下一步的计划
• 8.2.1 麦红吸浆虫滞育相关蛋白研究
• 8.2.2 麦红吸浆虫滞育的生理代谢机理研究
• 8.2.3 麦红吸浆虫滞育的内分泌学研究
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介