论文摘要
研究目的通过建立sD大鼠自由落体脑创伤模型,观察腹腔注射XNJ对大鼠急性颅脑创伤后脑水肿、BBB的损害及AQP4的影响,探讨其脑保护作用及作用机制。研究方法1.实验动物清洁级、健康、成熟sD雄性大鼠108只,体重300～350g。随机分为假手术组、脑外伤组和XNJ治疗组。后两组再分为伤后1、3、5、7d等4个亚组,每亚组12只。2.实验方法采用参照Feeney’S自由落体模型设计并适当改进的打击装置。用20 g重的击锤从30 cm高处自由坠落冲击撞杆,冲击力为600 g·cm,造成脑挫裂伤,制作大鼠脑创伤模型。XNJ治疗组在大鼠脑外伤模型做好后10 min内腹腔内注射XNJ 10mL·kg-1,每天一次。脑外伤组则腹腔内给予等量0.9%氯化钠溶液。假手术组仅行开颅术,不造成脑损伤。3.标本采集和检测3.1脑组织含水量检测将大鼠伤后第1、3、5、7d分别断头处死后,立即取出伤侧大鼠脑组织,110℃恒温箱烘烤24 h至恒重。用干湿质量法计算脑组织含水量。计算公式为:脑组织含水量（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。假手术组术后24 h做同样处理。3.2 BBB定量测定采用EB比色法。各组于处死前1 h通过股静脉注射2%EB(3mL·kg-1)。取脑组织前,快速开胸暴露心脏,迅速穿刺左心室后,剪右心房一小口,用37℃生理盐水500 mL灌注,至右心房流出清亮液体。取伤灶周边脑组织约0.2 g,加人5 mL甲酰胺,45℃水浴24 h,1500 r·min-1离心10 min,取上清液用HP8453型分光光度计（λ=635 nm）测其光密度值。用倍比稀释法制作标准曲线,再根据标准曲线求得脑组织EB含量,结果以μg·g-1（脑组织）表示。3.3 AQP4免疫组化染色各组大鼠在预定时间点在伤灶区周围取脑组织,4%甲醛固定24-48 h,石蜡包埋,然后切片行HE染色和免疫组化检查。以细胞膜呈棕黄色或褐色为AQP4阳性染色。应用NIKON彩色病理图文分析系统进行图像分析。3.4脑组织AQP4 mRNA的实时荧光RT-PCR测定分别取各组不同时间点的损伤周围脑组织进行RT-PCR分析,按Trizol试剂说明提取组织总RNA,逆转录为cDNA,以逆转录所得eDNA为模板进行PCR扩增。AQP4引物:上游5′GGT CCT CAT CTC CCTCTG CTT 3′,下游5′AAC CGT GGT GAC TCC CAA TCC3′,扩增片段长270 bp;β-肌动蛋白引物:上游5′TGT GAT GGT GGG TAT GGG 3′,下游5′TAG AAG CATTTG CGG TGC 3′,扩增片段长度为241 bp。反应体系50 uL,PCR条件:95℃预变性3 min;再95℃变性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸30 s,共40个循环。求得各基因的Ct值。采用2-ΔΔCt方法,即以管家基因β-肌动蛋白的Ct值标准化目的基因Ct值,得到各时点目的基因初始模板相对量,再计算各时点目的基因初始模板相对量与假手术组目的基因初始模板相对量的比值,分析各时点目的基因AQP4mRNA表达相对量的变化。4.统计学处理采用SPSS11.5统计软件包进行处理,资料以均数±标准差（（?）±s）表示,采用单因素方差分析方法（One-Way ANOVA）;P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1.各组大鼠脑含水量比较脑外伤组脑组织含水量伤后1d达高峰,并持续至第3d,第5d开始下降,第7天仍明显高于假手术组（P＜0.05）。XNJ组脑含水量也在第1d达高峰,后逐渐下降,但均明显低于脑外伤组（P＜0.05）;并于第7d降至接近正常,与假手术组比较无显著性差异（P＞0.05）。2.各组大鼠脑组织EB含量比较脑外伤组EB含量伤后1d达高峰,后逐渐下降,各时点均明显高于假手术组（P＜0.05）。XNJ组EB含量伤后1d达高峰,也逐渐下降,各时点均明显低于脑外伤组（P＜0.05）,但均不同程度高于假手术组。3.脑含水量与EB的相关分析脑含水量与EB的变化规律相同,相关分析得,r=0.898,P＜0.01,表明二者具有正性相关。4.AQP4免疫组化染色和AQP4 mRNA光学显微镜下观察,以细胞膜呈棕黄色或褐色为AQP4阳性染色。脑外伤组伤后1d AQP4免疫染色变深,它的mRNA水平上调,并持续至第3d,明显高于假手术组（P＜0.05）;在第5d开始下降,与假手术组比较无显著性差异（P＞0.05）。XNJ治疗后1、3 d的AQP4和AQP4 mRNA较脑外伤组明显上调（P＜0.05）。结论XNJ可以减轻创伤性脑水肿,可能与其减轻BBB破坏,上调AQP4表达有关。
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