论文摘要
目的（1）通过改良肿瘤组织移植的方法以获得良好的人脑胶质瘤裸小鼠脑内移植模型。在此基础上,去建立人脑多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform,GBM）和人肺腺癌脑转移瘤的裸小鼠模型,并探知其生物学特性能否保持其亲本肿瘤的特性。（2）培育表达绿色荧光蛋白（green fluoresent protein,GFP）的裸小鼠,将其用于人胶质瘤干细胞（human glioma stem cells,HGSCs）移植实验研究,并阐明HGSCs在宿主脑组织中具有播散和融合其它细胞的特征,以用于肿瘤组织重构的研究。方法（1）先用SHG-44胶质瘤细胞（1×107）注射于裸小鼠皮下,形成皮下移植瘤,再把皮下移植瘤组织通过自制的组织挤压装置放入24#无菌套管针,并调整肿瘤的体积为2.0mm3,然后把定量要移植的肿瘤组织块植入裸小鼠右尾状核,制作成裸小鼠脑内移植瘤模型。观察移植后裸小鼠生存状态。30d后解剖裸小鼠取脑并行病理切片,观察原位移植瘤的形态、病理学特征和成瘤率。（2）将体外培养高表达表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的人脑GBM细胞,在立体定向仪辅助下行裸小鼠右尾状核接种;继而将致瘤的组织通过自制的组织挤压装置放入24#无菌套管针,然后将2.0mm3的肿瘤组织经徒手操作接种于裸小鼠右尾状核,致瘤后即用裸小鼠的瘤组织再进行原位传代接种。接种后观察移植瘤的生长特性,并分析EGFR在各代移植瘤中的表达。（3）取人肺腺癌脑转移瘤组织块,通过自制的组织挤压装置放入24#无菌套管针,然后将2.0mm3的肿瘤组织经徒手操作接种于裸小鼠右尾状核。致瘤后即用裸小鼠的瘤组织再进行原位传代接种,然后观察致瘤率及荷瘤鼠生存期;HE染色分析各代移植瘤的组织学形态;MRI观察移植瘤在鼠脑内的大体形态;免疫组化染色观察移植瘤中CEA的表达;Alcian blue/PAS特殊染色检测移植瘤中粘液的性质。（4）将C57BL/6J-GFP转基因小鼠与NC系裸小鼠进行交配,在继代时严格挑选都表达GFP的无毛雄鼠（♂）与有毛雌鼠（♀）交配,通过肉眼和荧光显微镜等方法观察GFP在裸小鼠皮肤和脏器中的表达情况,继将HGSCs原位移植于表达GFP的裸小鼠,以观察移植瘤的生长情况。结果（1）通过改良的肿瘤组织块移植后,18只裸小鼠除3只接种当日死亡外,其余15只于移植后30d被处死取脑行冰冻切片,HE染色在光镜下见移植瘤侵袭性生长。致瘤率为93%（14/15）。（2）人GBM移植瘤组织在裸小鼠尾状核已连续传至13代,共130只鼠,荷瘤鼠生存期为19±1.33d。移植瘤病理学符合呈高度侵袭性生长、EGFR过表达的人脑GBM的特征。不同时间测得的肿瘤增殖曲线提示,致瘤的潜伏期短（<3d）,持续快速增殖期长（>15d）,进入晚期至死亡时间短（<3d）。（3）人肺腺癌脑转移瘤组织在裸小鼠右尾状核已连续传至6代,共65只鼠。荷瘤鼠生存期:原代为47.6±1.8d,2-3代有所缩短,4-6代稳定在38.0±0.9d;移植瘤病理为低分化腺癌,不向周围正常鼠脑组织侵袭;MRI示移植瘤类圆形,瘤周无水肿,与临床病例的MRI一致;移植瘤中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）表达阳性,并有酸性粘液存在。（4）GFP荧光裸小鼠已传至8代,包括脑在内的全身主要器官和细胞都发绿色荧光。对用于HGSCs原位移植的脑,能清晰辨认出不发光的瘤细胞和发光的宿主细胞。而瘤细胞经抗人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-Ⅰ抗体偶联红色荧光剂（PE）的免疫组织化学染色后,在共聚焦显微镜下可清晰显示HGSCs与宿主脑细胞的组织学关系是:多数播散,个别的发生细胞与细胞融合。结论（1）通过改良的组织定量移植具有操作简便,对小鼠创伤小,速度快,成瘤率高,便于批量制作原位移植裸小鼠模型。（2）人GBM肿瘤组织于鼠尾状核接种比传统的肿瘤细胞悬液接种,非但接种的细胞量大,还能将支持肿瘤细胞增殖的间质等其它成分一并植入,能较好体现临床上呈侵袭生长和过表达EGFR的高度恶性胶质瘤的特征。（3）人肺腺癌脑转移瘤组织块接种于鼠脑内建立的原位移植模型能更好地模拟临床原发肿瘤呈现低分化的病理学特征,并且具有缺乏侵袭性及CEA高表达的生物学特性,说明本方法为研究人肺腺癌脑转移瘤的生物学特性及实验治疗提供了一个可靠的动物模型。（4）用免疫功能健全、表达GFP的转基因鼠与免疫功能缺陷的裸小鼠杂交,可获得脑等组织器官表达GFP的裸小鼠。对其进行HGSCs原位移植,因可清晰辨认移植瘤与宿主组织的关系而有望用于肿瘤组织重构的研究。
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