论文摘要
支气管哮喘（Asthma）是严重威胁人类健康的一种常见慢性疾病,其发病率和死亡率在世界各地呈逐年上升的趋势,糖皮质激素虽能有效地控制其症状,但因其长期使用会出现不良反应,以及不能纠正机体已有的免疫紊乱和阻断疾病进程,因此临床上迫切需要寻找有效的途径来预防此类变态反应性疾病的发生与发展。研究表明,变态反应性疾病患者体内呈现过度的Th2型免疫应答,而结核杆菌等分枝杆菌感染可以诱导机体产生强烈的Thl型免疫应答。为改变机体对某些过敏原Th2优势应答的状态,我科曾成功将屋尘螨抗原Der p2基因转入卡介苗（BCG）中表达,制备出抗原重组BCG（rBCG）。经静脉和腹腔注射接种后,在小鼠体内诱导了Der p2特异性的Th1优势应答。这意味着象哮喘这类对某些特定抗原过敏的疾病,可以利用抗原rBCG作为疫苗而得到治疗。但是短期内重复注射接种rBCG会引起局部严重的迟发性变态反应而影响疗效。为此,进一步给小鼠口服Der p2-rBCG,结果同样诱导了抗原特异性的Th1应答。相关研究表明,口服分枝杆菌疫苗不仅能够刺激理想的免疫应答,而且经济方便。然而,分枝杆菌不是肠道定植菌,其与肠道粘膜的亲和力过低,大量口服还会引起肠道正常菌群失调和口咽部感染,从而影响免疫效果。研究发现,空肠弯曲菌（C.jejuni）外膜蛋白PEB1是C.jejuni的主要粘附分子,在C.jejuni与肠道粘膜的粘附中发挥重要作用,这为制备抗原特异性的肠道高亲和力重组分枝杆菌口服疫苗创造了条件。目的1.利用基因工程手段,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和C.jejuni PEB1抗原的重组耻垢分枝杆菌（rM.S）口服疫苗Der p2-PEB1-rM.S。2.将Der p2-PEB1-rM.S与Der p2-rM.S一起口服免疫小鼠,比较两者的生物学行为及免疫学特性,为临床应用提供实验依据。实验方法和结果1. PEB1蛋白的表达及纯化以C.jejuni Penner O:19标准株基因组为模板,用PCR法扩增PEB1基因,并与pUC19克隆载体连接,经测序证实与Genbank公布的C.jejuni PEB1基因序列完全一致。将PEB1基因克隆入pPRO EX HTb原核表达载体,酶切鉴定阳性重组质粒pPRO-PEB1,并用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明成功地表达了与预期分子量一致的PEB1融合蛋白;Western-blot证实该蛋白可与抗His-mAb发生特异性反应。可溶性分析显示该蛋白以可溶形式存在于上清中,用Ni-NTA亲和色谱法纯化获得了目的蛋白,纯度达90%以上。2.小鼠抗PEB1蛋白多克隆抗体的制备用皮下包埋的方法,以预先转移到硝酸纤维素膜上的纯化PEB1蛋白免疫BALB/c小鼠,共免疫三次,每次间隔2周,最后一次免疫结束2周后收集小鼠血清,同时设生理盐水对照。间接ELISA方法测定免疫小鼠血清中PEB1蛋白特异性抗体滴度为1:204800。3.胞壁表达Der p2-PEB1融合蛋白重组耻垢分枝杆菌的构建和鉴定用PCR法分别扩增PEB1和Der p2基因,经测序正确后按照相应的酶切位点将两者克隆入pUC19,得到Der p2-PEB1融合基因。将Der p2-PEB1融合基因亚克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭胞壁表达载体pCW,构建可胞壁表达Der p2-PEB1融合蛋白的重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并经酶切鉴定证实。将重组质粒电穿导入M.S感受态细胞,经潮霉素抗性筛选rM.S阳性克隆。阳性rM.S经PCR特异性扩增目的基因片段,证实其中含有目的基因。用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rM.S进行间接免疫荧光鉴定,证实Der p2-PEB1融合蛋白可以在M.S表面表达。4.消化道环境对重组M.S疫苗生物学行为的影响分别以100μl pCW-Der p2-PEB1-rM.S、pCW-Der p2-rM.S和M.S（1×1013 CFU·L-1）灌胃免疫BALB/c小鼠,连续5天。于首次免疫后第1、6、8、10、14、28、56d收集各组小鼠粪便,处理后涂布于7H10琼脂平板,培养后计数平板上M.S的CFU。分别于末次免疫后第2、14、28、56d处死小鼠,无菌分离肠道相关淋巴组织（GALT）、脾脏和肺脏,匀浆后涂布7H10琼脂平板,计数平板上M.S的CFU。结果显示,各组小鼠于口服免疫后次日即可在其粪便中排出M.S,第6天最多,随后逐渐减少,至免疫后2周完全消失,各组之间并无差异。小鼠口服免疫结束后第2、14、28天均能在GALT匀浆中检出M.S,其中pCW-Der p2-PEB1-rM.S组各时间点菌落数均较pCW-Der p2-rM.S组明显增加（P<0.05）。除第56天外,各组小鼠在其余各时间点均能在肺中检出少量M.S。而所有小鼠在各个时间点均未从脾脏中检出M.S。上述结果表明,PCW-Der p2-PEB1-rM.S更易于被肠道粘膜摄取并进入GALT。5.不同亲和力rM.S口服接种刺激BALB/c小鼠免疫应答的差异分别予以100μl pCW-Der p2-PEB1-rM.S、pCW-Der p2-rM.S、M.S（1×1013 CFU·L-1）和甘油灌胃免疫BALB/c小鼠,连续5天。于末次免疫后14、28、56天将小鼠摘眼球取血,收集血清,并制备脾淋巴细胞培养上清,用夹心ELISA法分别测定其中IFN-γ、IL-2和IL-4水平。结果表明,两种疫苗免疫后小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2水平均明显升高,Th2型细胞因子IL-4水平则明显下降;在小鼠脾淋巴细胞培养上清中加入Der p2刺激可使IFN-γ、IL-2含量升高、IL-4含量降低较M.S组更为明显;两种rM.S之间的比较也发现,pCW-Der p2-PEB1-rM.S组较pCW-Der p2-rM.S组IFN-γ、IL-2水平有明显升高,而IL-4水平无明显差异。这说明:rM.S免疫后在小鼠体内引发的免疫反应以诱导Th1优势为主,且这种应答是Der p2特异性的;PEB1导入rM.S后可以提高rM.S口服的免疫效率。结论:1.两种不同亲和力的rM.S疫苗pCW-Der p2-PEB1-rM.S和pCW-Der p2-rM.S口服免疫小鼠后均可通过消化道进入GALT;融合了PEB1蛋白后,消化道粘膜对rM.S的摄取量有所增加。2.它们免疫后在小鼠体内引发的免疫应答具有Th1优势的特征,且这种Th1优势是Der p2抗原特异性的;PEB1导入rM.S后可以提高rM.S口服的免疫效率。