BMP-2、VEGF基因修饰组织工程骨的实验研究

论文摘要

由于外伤、感染、肿瘤等因素使骨丧失了一些骨质,形成较大的间隙,称为骨缺损。在临床治疗上,骨缺损一直是常见的、难以治疗的疾病。目前主要采用自体骨,异体骨,人工合成替代物来进行修复,但这些方法都存在不足之处,难以满足临床上治疗的需要。随着组织工程学的发展,为治疗骨缺损提供了一条全新的道路。其基本方法是将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞接种于天然的或人工合成的、具有良好的生物相容性和可降解性的支架材料上,在生物反应器或其它体外构建环境中形成细胞/支架复合物,然后将这种复合物移植到动物体内组织缺损部位,最终完成组织缺损的修复和再造。在骨组织工程学的研究中,种子细胞、支架材料、细胞因子是三大要素。体外构建的组织工程骨是细胞与材料的复合体,自身无营养来源,植入体内后,依靠血液-细胞间液为种子细胞提供营养及氧气。若植入区血供不良或植入物血管化过程较长,附着在支架上的种子细胞可因缺乏营养而出现代谢紊乱,细胞增殖、分化及分泌功能受损甚至死亡,使得骨沉积作用不能有效替代降解的生物材料。近年来,组织工程骨的血运构建问题的重要性日益彰显,复合细胞的支架植入体内后,必须建立血运循环后,才能存活并行使其功能,因此,血运重建已被认为是骨组织工程的第四要素。本研究的目的是通过基因工程,细胞工程和组织工程学,构建一种能够具有这四大要素的组织工程骨,具有更高的成骨、成血管能力,以满足修复大段骨缺损的需要。利用贴壁法分离鼠的骨髓间充质干细胞,通过镜下观察细胞形态、流式细胞仪检测细胞周期、MTT法检测其生长特性、检测表面标记物、多方向诱导分化鉴定所分离细胞。构建BMP-2、VEGF基因及双基因的重组质粒,以骨髓间充质干细胞为靶细胞,进行基因转染。通过ELLISA、免疫组化等方法,证实目的基因能够在靶细胞中高表达。将骨髓间充质干细胞及转染细胞与nano-HA/PLGA支架材料复合,观察细胞与支架材料复合情况。本研究为进一步构建在体内具有成骨、成血管能力的组织工程骨提供了理论及实验数据。

论文目录

• 提要
• 第1章 前言
• 第2章 文献综述
• 2.1 组织工程学的研究进展
• 2.2 支架材料
• 2.3 种子细胞
• 2.4 细胞因子
• 2.5 组织工程骨的血管化
• 2.6 骨组织工程的发展前景及所面对的问题
• 参考文献
• 第3章 实验部分
• 第1节 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及体外分化的研究
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 BMSCs 分离、纯化及形态学特征
• 2.2 BMSCs 的细胞周期特征
• 2.3 BMSCs 的生长曲线
• 2.4 表面标志CD34、CD44 的表达
• 2.5 碱性磷酸酶活性测定
• 2.6 向脂肪细胞诱导分化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第2节 BMP-2、VEGF 及其双基因质粒的构建及鉴定
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR 分别扩增VEGF、BMP2
• 2.2 PCR 产物TA 克隆
• 2.3 VEGF 克隆入真核表达载体pEGFP-N1
• 2.4 BMP2 分别克隆入真核表达载体pEGFP-N1、pEGFP-N1/ VEGF
• 3 讨论
• 参考文献
• 第3节 重组质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞及其表达的检测
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 2 实验方法
• 2.1 质粒的制备
• 2.2 BMSCs 的培养
• 2.3 细胞的转染
• 2.4 大鼠BMSCs 质粒转染后的观察
• 2.5 MTT 法测定转染对细胞增殖情况的影响
• 2.6 ELISA 方法检测
• 2.7 RT-PCR 检测转染细胞的BMP-2、VEGF m RNA 表达水平
• 2.8 免疫组织化学染色分析BMP-2、VEGF 表达情况
• 2.9 I 型胶原、骨钙素、ALP 免疫组织化学染色
• 3 结果
• 3.1 转染细胞镜下观察
• 3.2 荧光显微镜下观察
• 3.3 转染细胞的MTT 实验
• 3.4 ELISA 方法检测BMP-2、VEGF
• 3.5 RT-PCR 结果
• 3.6 BMP-2 免疫组化染色结果
• 3.7 VEGF 免疫组织化学染色结果
• 3.8 ALP 免疫组化染色结果
• 3.9 I 型胶原免疫组化染色结果
• 3.10 骨钙素免疫组化染色结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第4节 体外构建组织工程骨
• 前言
• 1 材料
• 1.1 细胞和支架准备
• 1.2 主要试剂、仪器设备
• 2 方法
• 2.1 细胞准备
• 3 支架材料的准备
• 3.1 nano-HA/PLGA 的预湿
• 3.2 nano-HA/PLGA 支架材料上接种细胞
• 4 结果
• 4.1 黏附细胞计数
• 4.2 细胞形态学观察
• 4.3 扫描电镜观察支架材料上粘附细胞的情况
• 5 讨论
• 参考文献
• 第4章 结论
• 创新点
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT