四川白鹅和朗德鹅肝细胞间差异表达基因的筛选及鉴定

论文摘要

抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridizition,SSH）是以抑制PCR为基础的一种高效寻找差异表达基因的新方法。本研究应用SSH方法筛选四川白鹅和朗德鹅肝细胞间的差异表达基因,并综合运用生物信息学方法对EST序列进行筛选、鉴定,由此获得品种间差异相关EST信息。取得了以下主要实验结论:（1）利用改进“Seglen两步胶原酶灌注”法成功分离四川白鹅和朗德鹅肝细胞。经MTT比色法检测,在第1～2天细胞活性增加缓慢,在2～3天出现了一定的下降趋势,但在第3～5天细胞活性迅速增加,之后细胞活性再次降低,与理论“S”型生长曲线基本符合。（2）首次应用抑制性消减杂交技术成功构建了四川白鹅与朗德鹅肝细胞间正反向差异表达cDNA文库,共挑选出了3840个单克隆菌落,插入片段主要分布在250～750bp之间,呈随机分布,表明文库克隆的插入片断大小与预期的结果相符。SSH-1、SSH-2文库的有效阳性率分别达到了93%和91%。（3）应用斑点杂交技术从正反向cDNA消减文库中筛选差异表达的克隆,部分克隆经检测后,获得了65个在细胞中表达量明显上调的克隆,测序后得到个54个质量满意的差异EST。（4）通过BLASTn比对,在54个EST中共获得了50个已知基因、2个已知的EST和2个全新的EST。在这54个EST序列中,已知基因占92.6%;已知EST占3.7%;全新占EST为3.7%。所得到的已知基因按照基因功能初步分为信号转导与细胞间通信、细胞结构与运动、物质转运、细胞凋亡、细胞与机体防御、翻译与表达调控、代谢及其它共8类,其中参与信号转导/细胞间通信和细胞结构的两类基因所占比例分别为16%和28%,翻译与表达调控的基因占14%,其它功能方面基因所占比例较低。（5）肌动蛋白（actin rprotein,ACTB）、结缔组织生长因子（CTGF）、长链脂肪酸延伸酶基因（ELOVL）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase）、蛋白翻译起始因子（elFI）等基因在鹅不同性状的表达调控中可能发挥重要作用,有关这些基因的具体功能、它们的表达调控及其信号通路等还需要进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 不同鹅种的主要生产性能差异
• 1.1.1 产肝性能
• 1.1.2 生长速度与屠宰性状
• 1.1.3 肉质性状
• 1.2 基因差异表达的研究方法
• 1.2.1 消减杂交法（Subtractive Hybridization）
• 1.2.2 mRNA差异显示（mRNA differential display）
• 1.2.3 代表性序列差异分析（Representational Difference Analysis）
• 1.2.4 基因表达系统分析（serial analysis of gene expression,SAGE）
• 1.2.5 基因芯片（Gene chips）
• 1.2.6 抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridization）
• 1.3 抑制消减杂交技术在分离差异表达基因中的应用
• 1.3.1 SSH在医学疾病方面的应用
• 1.3.2 SSH在动物发育生物学方面的应用
• 1.3.3 SSH在畜禽功能基因组研究中的应用
• 1.4 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验样品
• 2.2 仪器和试剂
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 主要试剂盒和试剂
• 2.2.3 主要试剂配制
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 肝脏细胞的培养
• 2.3.2 肝细胞中总RNA的提取
• 2.3.3 mRNA分离纯化
• 2.3.4 抑制性消减杂交
• 2.3.5 消减文库生成
• 2.3.6 消减cDNA文库的斑点杂交筛选
• 2.3.7 序列测定
• 2.3.8 差异表达EST生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 肝细胞的形态及活性变化
• 3.2 肝细胞中总RNA提取、MRNA纯化及检测
• 3.3 抑制消减杂交
• 3.3.1 双链cDNA（dscDNA）的合成与酶切
• 3.3.2 接头连接效率检测
• 3.3.3 消减产物第二次PCR扩增
• 3.3.4 消减效率检测
• 3.3.5 消减文库中插入片段的PCR鉴定
• 3.4 斑点杂交
• 3.5 差异表达克隆序列分析
• 3.5.1 测序、序列同源性检索及EST分类
• 3.5.2 差异表达克隆中已知基因序列的分析
• 3.5.3 差异表达克隆中已知EST分析
• 3.5.4 差异表达克隆中全新的EST
• 3.5.5 差异表达基因功能相关分析
• 4 讨论
• 4.1 肝细胞的分离和纯化
• 4.2 肝细胞的活性检测
• 4.3 抑制消减杂交的质量检测
• 4.4 斑点杂交筛选阳性差异表达克隆
• 4.5 已分离的差异表达基因的特征
• 4.5.1 肌动蛋白（actin rprotein,ACTB）
• 4.5.2 结缔组织生长因子（conective tissue gowth factor,CTGF）
• 4.5.3 长链脂肪酸延伸酶（Elongation of long-chain fatty acids,ELOVL）
• 4.5.4 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase）
• 4.5.5 翻译起始因子（eukaryotic translation initiationfactor,eIF）
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间所参与科研项目和发表的学术论文