产类细菌素乳酸菌的分离、筛选与鉴定及发酵条件研究

论文摘要

类细菌素是由细菌产生的一种对多种微生物都有一定抑菌、防腐作用的活性物质,具有安全性、无毒副作用等特点,近年来在食品工业生产中得到了广泛重视与应用。类细菌素可由多种细菌产生。微生物菌种的分离源不同,其所产类细菌类的抑菌活性和特性也有一定差异。为了获得生产和应用潜力较高的类细菌素产生菌株,本文以泡菜为分离源,从中分离得到了一株类细菌素高产菌株,并对其进行了分类鉴定,确定了该类细菌类的特性及其在食品保鲜中的应用效果,同时对其产类细菌素的发酵条件进行优化。获得主要结果如下:（1）以各地采集的泡菜为样本,采用10mlEp管培养菌液,CaCO3中和酸法筛选产抑菌活性物质的乳酸菌,结合传统筛选方法,共分离纯化得到299株乳酸菌。采用这一筛选模式,经反复分离筛选得到一株具有广谱抑菌活性物质的产生菌,菌株编号为SD-22。（2）根据菌种的形态特性和生理生化特性,结合16SrDNA分子生物学鉴定,将SD-22菌株鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。（3）在排除酸性产物和过氧化氢的干扰后,SD-22菌株发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）等G+菌以及大肠杆菌（Escherichia coli）,鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等G-菌有强烈的抑制作用,对部分真菌也有抑制作用,表明该菌株产生具有广谱抑菌活性的物质,属于类细菌素,命名为Lactobacillin SD-22。该活性物质对蛋白酶不敏感,经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后发酵液抑菌活性基本不变;它具有很好的热稳定性;在酸性条件下活性高;具有较广的抗菌谱。（4）通过单因素试验设计和正交试验设计,确定SD-22产生类细菌素的最佳发酵条件为30℃厌氧培养48h,培养基初始pH为6.5,接种量为1%,接种种龄为12h。培养基组分最佳组合为大豆蛋白胨15g、酵母粉15g、牛肉膏5g、葡萄糖20g、K2HPO4 2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、MgSO4?7H2O 0.58g、MnSO4?4H2O 0.25g、Tween-80 2mL,蒸馏水定容至1000mL。此条件下培养乳酸菌SD-22抑菌圈直径可达20.12mm。（5）对类细菌素LactococcinSD-22的保鲜应用的初步研究结果表明,SD-22保鲜液对猪肉有一定的保鲜作用,4℃条件下保鲜液可以延长保鲜期2d,25℃条件下可以延长12h。另外,保鲜液在4℃和25℃条件下均能显著抑制猪肉中沙门氏菌的生长。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 天然防腐剂的发展
• 1.2.1 来源于植物的天然防腐剂
• 1.2.2 来源于动物的天然防腐剂
• 1.2.3 来源于微生物的天然防腐剂
• 1.3 乳酸菌、乳酸菌素和乳酸菌类细菌素
• 1.3.1 乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）
• 1.3.2 乳酸菌素（Bacteriocin of LAB）
• 1.3.3 乳酸菌类细菌素（Bacteriocin-like inhibitory substance，BLIS）
• 1.4 乳酸菌类细菌素的研究进展
• 1.4.1 产类细菌素的菌株
• 1.4.2 类细菌素的活性检测
• 1.4.3 类细菌素的性质
• 1.4.4 类细菌素的作用方式
• 1.4.5 类细菌素的发酵条件
• 1.4.6 类细菌素的分离纯化
• 1.4.7 类细菌素的分子生物学
• 1.4.8 类细菌素的应用
• 1.5 本论文的研究内容
• 第二章 产类细菌素乳酸菌的分离筛选
• 2.1 试验材料与仪器
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 指示菌种
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 乳酸菌的分离和纯化
• 2.2.2 有抑菌活性物质乳酸菌的筛选
• 2.2.3 产类细菌素乳酸菌的筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌种的分离与纯化
• 2.3.2 产抑菌活性物质的乳酸菌的筛选
• 2.3.3 产类细菌素菌种的筛选
• 2.4 本章小结与讨论
• 2.4.1 小结
• 2.4.2 讨论
• 第三章 产类细菌素乳酸菌SD-22 的鉴定
• 3.1 实验方法及步骤
• 3.1.1 菌体形态及菌落特征
• 3.1.2 生理生化实验
• 3.1.3 16SrDNA 分子鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 菌体形态和菌落特征
• 3.2.2 生理生化鉴定
• 3.2.3 SD-22 16SrDNA 测序结果
• 3.3 本章小结与讨论
• 3.3.1 小结
• 3.3.2 讨论
• 第四章 Lactobacillin SD-22 粗提液的生物学特性
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器与设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 Lactobacillin SD-22 活性的热稳定性
• 4.2.2 Lactobacillin SD-22 活性的pH 稳定性
• 4.2.3 Lactobacillin SD-22 活性的蛋白酶敏感性
• 4.2.4 Lactobacillin SD-22 的抑菌谱
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Lactobacillin SD-22 活性的热稳定性
• 4.3.2 Lactobacillin SD-22 活性的pH 稳定性
• 4.3.3 Lactobacillin SD-22 活性的蛋白酶敏感性
• 4.3.4 Lactobacillin SD-22 的抑菌谱
• 4.4 本章小结与讨论
• 4.4.1 小结
• 4.4.2 讨论
• 第五章 Lactobacillin SD-22 的发酵条件优化
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 主要仪器与设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 培养方法
• 5.2.2 抑菌实验
• 5.2.3 实验设计
• 5.2.4 菌体生长量测定
• 5.2.5 溶液pH 值的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 培养条件优化
• 5.3.2 培养基营养成分的优化
• 5.4 本章小结与讨论
• 5.4.1 小结
• 5.4.2 讨论
• 第六章 Lactobacin SD-22 用于肉类保鲜的初步研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌株
• 6.1.2 猪肉
• 6.1.3 培养基
• 6.1.4 主要仪器与设备
• 6.2 方法
• 6.2.1 试剂的配制
• 6.2.2 猪肉的保鲜应用
• 6.2.3 发酵液对猪肉中沙门氏菌的抑制效果
• 6.2.4 定期取样检测
• 6.2.5 细菌总数和菌群的测定
• 6.2.6 感官参数
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 猪肉的保鲜应用
• 6.3.2 发酵液对猪肉中沙门氏菌的抑制效果
• 6.4 本章小结与讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介