淇河鲫生长激素全长cDNA的克隆、序列分析及真核表达

论文摘要

在我国淡水养殖已有2000多年的历史,淡水养殖在我们的生活中占有很重要的地位。淇河鲫是产于河南省淇河的自然三倍体雌核发育鲫鱼,以生长快、味道美和效益高等优点而久负盛名,具有良好的开发前景。为了提高其生长速度,缩短养殖周期,为市场提供优质产品,促进淇河鲫养殖业的健康持续发展,目前急需研制安全高效的新型鱼用生长促进剂来促进生长和保证食品安全。鱼类生长激素是由脑垂体分泌的多肽类激素,参与鱼类的生长、发育、代谢、食欲和渗透压的调节,广泛应用于鱼类内分泌学、摄食和食物转化效率、生长等的研究。但是由于天然生长激素难以大量获得,限制了其功能和应用研究。另一方面外源生长激素在鱼体内分解消失快,不会在鱼体中积累,这一结果提示,重组生长激素蛋白的应用可能以本原动物来源的为好。本试验进行了淇河鲫生长激素基因cDNA的克隆与序列分析,推导出蛋白质序列并与其他鱼类的生长激素进行了同源性比较和进化系统分析,为从分子水平上了解淇河鲫生长规律打下基础。在真核表达实验中,根据已取得的淇河鲫生长激素的序列全长,在开放性阅读框架两端设计特异引物,用RT-PCR扩增,得到大小为633bp的一个产物,进行测序验证,完全在前测定序列的开放性阅读框架内。将构建好的载体转入大肠杆菌DH5a中进行克隆,用PCR初步筛选出重组子,以EcoRI,SnaBI双酶切做进一步鉴定后,将重组子命名为PPIC9K—GH,并进行序列测定为下一步实验提供重组子。重组质粒经线性化等处理,电击转化导入毕赤酵母GS115中,经MD、G418筛选得到高抗性的阳性菌,抽提酵母基因组进行PCR确定重组载体已经整合到酵母中,并对整合到酵母中的阳性菌进行测序和序列分析。将阳性菌株接种于培养基中,用甲醇进行诱导表达,SDS-Page凝胶电泳,对阳性菌表达的蛋白进行比对分析,在22kDa处有明显条带,说明生长激素在毕赤酵母GS115中获得了分泌表达。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 淇河鲫研究概况
• 1.2 鱼类生长激素（GH）研究概况
• 1.2.1 鱼类生长激素（GH）的研究水平
• 1.2.2 鱼类生长激素对鱼类生长作用机制研究
• 1.2.3 重组鱼类生长激素及其应用的研究
• 1.3 毕赤巴斯德酵母表达系统
• 1.3.1 毕赤巴斯德酵母表达系统的优点
• 1.3.2 毕赤巴斯德酵母生物学特点
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 淇河鲫生长激素 cDNA 的克隆与序列分析的材料和方法
• 3.1.1 试验材料材料与方法
• 3.1.1.1 试验所用到的仪器
• 3.1.1.2 试验所用到的药品和试剂
• 3.1.1.3 溶液及其配制方法
• 3.1.1.4 培养基及其配制方法
• 3.1.1.5 试验动物
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 引物的设计和合成
• 3.1.2.2 淇河鲫垂体总 RNA 的提取和检测
• 3.1.2.3 淇河鲫脑垂体总 RNA 的反转录
• 3.1.2.4 淇河鲫 GH cDNA 部分片段的扩增
• 3.1.2.5 淇河鲫 GH cDNA 3’端（下游区）片段的扩增
• 3.1.2.6 淇河鲫 GH cDNA 5’端（上游区）片段的扩增
• 3.1.2.7 目的片段的回收纯化
• 3.1.2.8 回收后 PCR 产物的连接转化
• 3.1.2.9 重组质粒的筛选、克隆及保菌
• 3.1.2.10 重组质粒的提取
• 3.1.2.11 重组质粒的鉴定
• 3.1.2.12 重组质粒DNA序列测定、分析、比较及系统进化树的构建
• 3.2 PPIC9k--GH 的构建、克隆及在毕赤酵母 GS115 中的分泌表达的材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 生长GH 基因
• 3.2.1.2 菌株、质粒与工具酶
• 3.2.1.3 化学试剂及试剂盒
• 3.2.1.4 储液和培养基
• 3.2.1.4.1 储液
• 3.2.1.4.2 培养基
• 3.2.1.5 主要仪器设备
• 3.2.1.6 试验动物
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 引物的设计和合成
• 3.2.2.2 PCR 扩增
• 3.2.2.3 PCR 产物的纯化
• 3.2.2.4 双酶切 PCR 产物及表达载体 PPIC9k
• 3.2.2.5 DNA 快速回收试剂盒回收酶切产物
• 3.2.2.6 目的基因与表达质粒的连接转化
• 3.2.2.7 重组质粒的筛选、克隆及保菌
• 3.2.2.8 重组质粒的鉴定
• 3.2.2.8.1 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.2.8.2 重组质粒的DNA 序列测定
• 3.2.2.9 大量提取重组表达质粒PIC9k-GH
• 3.2.2.10 电转化DNA 样品的制备
• 3.2.2.11 巴斯德毕赤酵母菌株GS115 感受态细胞的制备
• 3.2.2.12 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的电转化
• 3.2.2.13 阳性转化子的抗性筛选
• 3.2.2.14 转化子的PCR鉴定
• 3.2.2.15 用于PCR 鉴定的酵母基因组的抽提
• 3.2.2.16 酵母转化子的基因组的PCR鉴定
• 3.2.2.17 不同重组毕赤酵母菌株的诱导表达筛选
• 3.2.2.18 上清蛋白质沉淀法
• 3.2.3 发酵表达上清液的SDS-PAGE 检测
• 3.2.3.1 SDS-PAGE 试剂的配制
• 3.2.3.2 分离胶和浓缩胶的配置
• 3.2.3.3 制备样品和上样
• 3.2.3.4 电泳
• 3.2.3.5 考马斯亮蓝染色
• 4 结果与分析
• 4.1 淇河鲫生长激素cDNA 的克隆与序列分析的结果与分析
• 4.1.1 淇河鲫垂体总 RNA 的提取
• 4.1.2 淇河鲫GH cDNA 部分片段的扩增
• 4.1.3 淇河鲫生长激素cDNA 3’端序列的克隆
• 4.1.4 淇河鲫生长激素cDNA 5’端序列的克隆
• 4.1.5 淇河鲫生长激素cDNA 碱基序列与其它动物的相似性比较
• 4.1.6 淇河鲫生长激素氨基酸成分分析
• 4.1.7 不同动物生长激素氨基酸序列的同源性比较分析
• 4.1.8 鱼类生长激素和其它脊椎动物生长激素的进化分析
• 4.2 PPIC9k--GH 的构建、克隆及在毕赤酵母 GS115 中的分泌表达的结果与分析
• 4.2.1 淇河鲫 GH cDNA 部分片段的扩增
• 4.2.2 重组质粒的菌液 PCR 鉴定
• 4.2.3 重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.4 淇河鲫生长激素序列的测定
• 4.2.5 酵母阳性转化子的 PCR 鉴定
• 4.2.6 酵母转化子的基因组的 PCR 鉴定
• 4.2.7 表达产物的 SDS-PAGE
• 5 讨论
• 5.1 鱼生长激素应用现状及展望
• 5.2 表达载体的选择与构建
• 5.3 外源基因在酵母中的整合方式
• 5.4 电击转化条件对酵母转化的影响
• 5.5 用PCR 方法对酵母转化子进行鉴定
• 5.6 影响表达量的因素
• 参考文献
• 英文摘要