MAPKs介导NMDA兴奋性神经毒及Humanin的神经保护作用观察

论文摘要

谷氨酸是中枢神经系统重要的神经递质,介导各种兴奋性突触传递。在胚胎期神经发育、成年脑的各种兴奋性突触传递、突触的可塑性等方面发挥重要作用。然而,谷氨酸在突触间隙的过度聚集可引起神经元损伤甚至死亡,被称为兴奋性神经毒。兴奋性神经毒参与多种神经病理过程,如脑缺血损伤和各种神经退行性疾病等。研究显示,缺血或创伤时,脑组织间隙谷氨酸浓度迅速增高。过度聚集的谷氨酸导致突触后膜谷氨酸受体的过度激活,尤以N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体为著。NMDA受体是离子型受体,受谷氨酸（内源性神经递质）或NMDA（外源性激动剂）激活使耦联的Ca2+通道开放,引起胞内Ca2+升高即Ca2+信号的改变,由此发挥其生物学效应,包括生理效应和毒性作用。新近的研究发现,NMDA受体激活引起的Ca2+浓度升高还可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）介导其毒性作用,由此导致细胞损伤包括凋亡等。兴奋性神经毒模型是最常用（被普遍公认）、最具毒性（既可引起坏死,也可引起凋亡）、损伤机制最复杂（涉及Ca2+超载、氧化应激、线粒体功能障碍、细胞坏死及凋亡等）、最具临床意义（兴奋性神经毒参与了几乎所有神经病理过程,如脑缺血损伤,各种神经退行性疾病等）的一个神经损伤模型。MAPKs是一条多途径信号通路,包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38 MAPK的不同途径,且每条途径的生理及病理意义不尽相同。不同的损伤引起MAPKs的不同途径参与,而且每条途径活化后产生的生物效应也不同。虽有报道显示,MAPKs在NMDA的兴奋性神经毒过程发挥作用,但每条途径的作用大小及相互间的作用并不明确。因此,在同一实验条件下系统观察并分析NMDA-MAPKs各途径在兴奋性神经毒过程的作用,对深化理解兴奋性神经毒机制有重要意义,而MAPKs系统也可能成为针对兴奋性神经毒的重要靶点。Humanin（HN）是一个由24个氨基酸残基组成的多肽,首先从阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的患者脑内分离得到。这种多肽能有效、特异地抑制家族性AD（familial Alzheimer’s disease, FAD）等多种基因突变和Aβ（amyloid beta-peptide）诱发的神经元死亡,因而被认为是AD特异或AD相关毒性的神经保护肽。所以早期的研究更多关注的是HN对AD相关毒性的神经保护作用。近来有研究表明,HN可能具有更广泛的神经保护作用。例如,HN可使人脑血管平滑肌细胞免受Aβ诱导产生的毒性影响;也可防止未分化的PC12细胞产生的由血清缺乏诱导的细胞凋亡;HN还可拮抗阮病毒蛋白片段所致的皮层神经细胞死亡和凋亡。小鼠的在体实验发现,HN可以改善东莨菪碱或Aβ造成的学习记忆功能下降。我们近期的研究也发现,HN能保护大鼠皮层神经元免于NMDA诱导的兴奋性神经毒。鉴于以上分析,本研究的主要目的在于:（1）使用MAPKs各途径的选择性抑制剂系统观察MAPKs通路中ERK、JNK和p38 MAPK三条不同途径在介导NMDA毒性（细胞活力降低、细胞损伤和细胞死亡）过程中的作用以及HN的神经保护作用;（2）观察凋亡在NMDA介导的神经损伤中的作用,并进一步明确MAPK三条途径在NMDA介导的细胞凋亡中的作用及HN的神经保护作用;（3）在上述观察的基础上,进一步明确HN保护作用的机制或作用靶点。首先采用细胞内钙成像技术观察HN对NMDA引起的钙稳态变化的影响;并利用Western Blot分析NMDA对MAPK三条途径的活化及HN的拮抗作用,以明确每条途径发挥作用的大小及HN的作用靶点。本研究将进一步深化对兴奋性神经毒机制的认识和对HN神经保护机制的理解。第一部分MAPKs介导NMDA诱导的神经损伤及HN拮抗作用的观察NMDA受体过度激活是导致神经细胞损伤乃至死亡的主要原因,同时也被认为是引起急、慢性脑损伤性疾病（如脑卒中/脑缺血及某些神经退行性疾病）的重要机制。为进一步深入分析NMDA（100μmol/L,2h）所致神经损伤的机制,本研究将应用MAPKs特异性抑制剂,分析MAPKs通路中细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38 MAPK三条不同途径在介导NMDA毒性过程中的作用。结果显示:（1）细胞活力检测,NMDA预处理使培养神经元细胞活力明显下降（WST-8分析）,而JNK抑制剂SP600152和p38 MAPK抑制剂SB203580均可剂量依赖性地抑制NMDA引起的细胞活力的下降。SP600152使细胞活力恢复10.36% （P < 0.05,IC50值18.75μmol/L）,SB203580使细胞活力恢复20.96%（P < 0.05,IC50值7.97μmol/L）。SP600125（20μmol/L）和SB203580（10μmol/L）二者的联合应用,抑制作用明显增加大于任何单一阻断剂的作用,可使细胞活力恢复27.07%（P < 0.05）。此外,HN预处理皮层神经元也产生明显的抑制作用,细胞活力恢复37.99%（P < 0.05）;而ERK抑制剂PD98059 （1050μmol/L）不表现抑制作用;（2）LDH检测,NMDA预处理使培养神经元LDH释放明显增多,而SP600125（20μmol/L）或SB203580（10μmol/L）或二者联合,或HN作用,分别使NMDA所致的LDH释放减少23.08%（P < 0.05）、32.90%（P < 0.05）、42.06%（P < 0.05）和49.90%（P < 0.05）;PD98059（20μmol/L）同样没有作用;（3）Calcein-AM染色（活细胞检测）,NMDA预处理使培养神经元的活细胞数量明显减少,即Calcein-AM染色的阳性细胞减少。而SP600125（20μmol/L）或SB203580（10μmol/L）或二者合用,或HN预处理皮层神经元,分别使活细胞数量增加9.52%（P < 0.05）、18.10%（P < 0.05）、25.19%（P < 0.05）和29.88%（P < 0.05）;PD98059（20μmol/L）也没有作用;（4）活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）检测,NMDA预处理诱导产生ROS,并在第12 h达到峰值;SP600125（20μmol/L）或SB203580（10μmol/L）或二者联合,或HN作用,均显著抑制了NMDA诱导的ROS的生成,分别抑制17.94%（P < 0.05）、33.68%（P < 0.05）、45.33%（P < 0.05）和75.47%（P < 0.05）;ERK抑制剂仍没有作用。以上结果提示:（1）JNK和p38 MAPK途径,而非ERK途径,是NMDA引起神经损伤的重要信号通路;（2）在NMDA诱导的神经损伤中,p38 MAPK的作用比JNK更为显著,而且这两条途径可能以相互协同的方式发挥作用;（3）NMDA通过活化的JNK和p38 MAPK途径,使ROS的生成明显增加,这可能是诱发神经细胞死亡的重要机制;（4）HN可拮抗MAPKs介导的神经损伤发挥保护作用,而且拮抗作用强于单一或联合应用的MAPKs抑制剂。第二部分MAPKs介导NMDA诱导的皮层神经元凋亡及HN拮抗作用的观察NMDA诱导的兴奋性神经毒造成神经损伤,并导致神经细胞的死亡,早期认为主要以坏死为主。新近的资料包括本研究室的研究表明,NMDA也可通过引起凋亡参与兴奋性神经毒引起的神经元死亡。本实验在NMDA（100μmol/L,2 h）诱导的兴奋毒细胞模型中,应用caspase抑制剂（阻断caspase依赖的神经元凋亡）检测凋亡在NMDA所致细胞死亡中的作用（凋亡所占比例）。为进一步明确MAPKs各信号途径在NMDA致细胞凋亡中的作用,使用选择性抑制剂观察MAPK三条途径在NMDA介导的细胞凋亡中的作用。结果显示:（1）NMDA（100μmol/L,2 h）预处理使培养神经元死亡数量明显增加,应用caspase抑制剂可使NMDA引起的神经元死亡比例下降22.49%,提示caspase依赖的凋亡比例可能占细胞死亡的22.49%;（2）与NMDA组相比,p38 MAPK抑制剂SB203580（10μmol/L）或HN（10μmol/L）预处理后的皮层神经元,其caspase-3活性（反映凋亡的指标）分别降低30.43%（P < 0.05）和32.20%（P < 0.05）;而在此过程ERK抑制剂PD98059（20μmol/L）和JNK的抑制剂SP600125（10μmol/L）都没有发挥作用;（3）TUNEL结果显示,NMDA所致的细胞凋亡比例为33.63%;与NMDA组相比,SB203580（10μmol/L）或HN（10μmol/L）分别使NMDA引起的TUNEL阳性细胞数减少33.10%（P < 0.05）和33.99%（P < 0.05）;PD98059（20μmol/L）和SP600125（10μmol/L）没有作用;（4）流式结果显示,NMDA组细胞凋亡比例为30.33%;SB203580（10μmol/L）或HN（10μmol/L）预处理皮层神经元后,使NMDA所致的细胞凋亡分别减少45.14%（P < 0.05）和49.84%（P < 0.05）;同样,PD98059和SP600125仍没有作用。以上结果表明:（1）NMDA介导的细胞死亡除坏死外,还伴有一小部分凋亡（caspase依赖的凋亡）;（2）p38 MAPK途径,而非JNK和ERK途径,介导了NMDA诱导的皮层神经元凋亡,抑制与此相关的凋亡信号通路发挥神经保护作用;（3）JNK途径可能介导了NMDA所致的神经细胞坏死而非凋亡;（4）HN通过抑制NMDA诱导的神经细胞凋亡发挥保护作用。第三部分NMDA对MAPKs的活化及HN拮抗作用的观察NMDA介导的兴奋性神经毒已被广泛研究,但有关HN对NMDA神经毒的保护作用研究甚少。前两部分实验的研究结果显示,HN可有效拮抗NMDA诱导的神经损伤,同时拮抗NMDA诱导的凋亡。本研究在前期实验的基础上,进一步观察NMDA对MAPKs各信号途径的活化和HN的拮抗作用及可能的靶点。在本部分实验,我们首先通过观察HN对NMDA引起的钙信号变化的影响,明确HN是否通过与NMDA受体的直接作用而发挥作用;再利用Western Blot技术观察NMDA对MAPKs三条途径的活化及HN的拮抗作用。结果如下:（1）钙离子荧光成像实验结果提示,给予NMDA引起的胞内钙水平增高至对照组的162.81%（P < 0.05）,但HN处理后没有改变NMDA诱导的钙水平增高;（2）Western Blot结果显示,NMDA诱导了磷酸化的JNK1水平升高,第6 h达到峰值（P < 0.05）,而在检测的12 h仍维持在高水平;而磷酸化JNK2的增加只出现在NMDA处理后的第12 h（P < 0.05）;HN预处理后显著抑制NMDA诱导的JNK1的活化,在第6 h和第12 h分别减少32.10%和11.79%（P < 0.05）;同时HN对NMDA诱导的JNK2在第12h的活化抑制19.24%（P < 0.05）;（3）在NMDA作用后的第3 h,6 h,和12 h,p-p38 MAPK的水平升高（P < 0.05）,第6 h达到峰值;HN预处理对NMDA诱导的p38 MAPK的活化也表现出拮抗作用,在第3 h、第6 h和第12 h分别抑制16.98%、35.98%和12.36%,其中在第6 h抑制作用最为显著（P < 0.05）。NMDA对ERK的表达和p-ERK没有影响。上述结果提示:（1）NMDA可通过活化JNK1/2和p38 MAPK途径而发挥作用,而NMDA对ERK途径没有活化作用。此结果与前述阻断剂的实验结果相一致;（2）由于NMDA诱导的p38 MAPK和JNK的活化（6 h）早于ROS的产生（12 h）,因此活化的p38 MAPK和JNK可能通过促进ROS的产生而引起细胞损伤;（3）HN拮抗NMDA-MAPKs系统的作用靶点可能不在NMDA受体而是在其下游,最终影响到MAPKs的各途径;（4）鉴于HN相对单一或联合使用的MAPKs抑制剂表现出更为有效的拮抗作用,我们推测HN除作用于JNK和p38 MAPK信号途径外,还可能通过其他信号途径发挥神经保护作用。结论:（1）本研究在同一实验条件（NMDA神经毒实验模型）下,利用不同的检测手段系统观察并分析了NMDA对MAPKs各途径的活化及不同途径在介导NMDA毒性过程的作用,深化了对NMDA毒性机制的理解;（2）JNK和p38 MAPK途径,而非ERK途径,是NMDA引起神经损伤的重要信号通路;p38 MAPK的作用比JNK更为显著,而且这两条途径可能以相互协同的方式发挥作用;（3）NMDA可能通过活化JNK和p38 MAPK途径,使ROS的生成明显增加,这可能是造成神经损伤及诱发皮层神经细胞死亡的重要因素;（4）p38 MAPK途径,而非JNK（和ERK）途径,介导了NMDA诱导的皮层神经元凋亡;JNK途径可能介导了NMDA所致的神经细胞坏死;（5）HN通过拮抗NMDA-JNK和NMDA-p38 MAPK通路的活化而发挥其神经保护作用;HN作用的靶点可能不是NMDA受体本身而是其下游信号,最终影响到MAPKs各途径的作用;（6）HN可能通过拮抗NMDA-JNK和NMDA-p38 MAPK通路的活化而抑制ROS的产生,使细胞免于死亡而发挥保护作用;（7）HN除作用于JNK和p38 MAPK信号途径外,还可能通过其他信号途径发挥对NMDA诱导的兴奋性神经毒的保护作用。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• Part I: Roles of the MAPK Pathways in NMDA-induced Excitotoxicity and Neuroprotection by Humanin
• Abstract
• Introduction
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• References
• Part II: Roles of the MAPK Pathways in NMDA-induced Apoptosis and Neuroprotection by Humanin
• Abstract
• Introduction
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• References
• Part III: NMDA-mediated Activation of the MAPK Pathways and Antagonism by Humanin
• Abstract
• Introduction
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• References
• 综述
• 个人简历
• 致谢