论文摘要
前列腺癌是男性肿瘤疾病中发病率最高的恶性肿瘤之一,在发达国家中其死亡率高居第二位,在我国其发病率也有逐年增高的趋势。前列腺癌的发生,发展和转移与NKX3.1密切相关。NKX3.1是前列腺特异表达的、受雄激素调节的同源盒基因,在前列腺胚胎发育、上皮分化及肿瘤发生发展中起重要作用。在胚胎形成过程中,NKX3.1的表达可作为前列腺上皮分化的重要标志。NKX3.1基因敲除的老鼠显示前列腺上皮发育不良、腺管形态异常和蛋白分泌障碍,表明NKX3.1对于前列腺的正常发育及维持前列腺上皮的正常分化是必需的。而且NKX3.1基因敲除鼠随着年龄的增长,出现了类似于人前列腺上皮内瘤的病理变化,表明NKX3.1缺失可能与前列腺癌的起始有关。人同源盒基因NKX3.1位于染色体8p21,包括两个外显子,一个内含子,较短的5′-非翻译区和较长的3′-非翻译区。约80%的前列腺肿瘤中存在该区域的杂合缺失,表明NKX3.1在前列腺癌中可能作为抑癌基因发挥作用。但也有研究显示不同的结果,有研究表明在前列腺癌标本中存在NKX3.1过表达情况,同时比较转移灶与原发灶的NKX3.1的表达情况,发现转移灶中NKX3.1过表达明显高于原发灶,说明NKX3.1过表达可能与前列腺癌的侵袭性有关。这表明NKX3.1与前列腺癌的发生和发展密切相关,但其作用可能是复杂多变的。目前关于人同源盒基因NKX3.1在前列腺发育和前列腺癌发生发展中的作用及其基因表达调控机制尚不完全清楚,有待于进一步研究探讨。本课题对人同源盒基因NKX3.1的表达调控进行了初步研究。研究了人同源盒基因NKX3.1内含子及10段5′上游10 kb调控区的调控元件,并未发现明显的雄激素反应元件和组织特异性增强区域,在5′上游调控区-6548～-6505 bp发现一个功能性的正调控区并对该作用元件及结合蛋白做了初步鉴定。研究发现Sp1过表达对人同源盒基因NKX3.1有增强作用,并在NKX3.1启动子区鉴定了其功能性元件。同时本课题研究了抑癌基因p53及姜黄素对人同源盒基因NKX3.1的作用及其机制,结果表明p53及姜黄素可以通过抑制雄激素受体（androgenreceptor,AR）表达及其DNA结合活性从而抑制AR对人同源盒基因NKX3.1的转录激活作用。这些为进一步阐明NKX3.1基因表达调控机制奠定了基础,并为了解其在前列腺发育及肿瘤发生发展中的作用提供了新的思路。第一部分人同源盒基因NKX3.1内含子及5′上游10 kb调控区功能元件的鉴定研究目的:分段克隆人同源盒NKX3.1基因5′上游10kb调控区域及内含子,检测其对启动子活性的影响,鉴定其调控元件及其相互作用的蛋白因子,检测雄激素反应元件和组织特异性增强子,为进一步研究人同源盒NKX3.1基因表达调控机制及DNA顺式元件与其结合蛋白的相互作用机制奠定基础。研究方法和结果:1.本实验室前期工作已经证明在NKX3.1基因5′上游-212～+48 bp存在基本启动子活性。根据基因数据库中的NKX3.1基因序列,利用PCR技术构建521 bp启动子（-473～+48 bp）-荧光素酶报道基因质粒（pGL3-521）。进一步利用PCR技术构建内含子-521 bp启动子-荧光素酶报道基因质粒（pGL3in-521）;并分10段（1至10）分别构建NKX3.1基因5′上游调控区-521 bp启动子-荧光素酶报道基因质粒（pGL31-521至pGL310-521）,每个片段重叠200 bp左右。经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒结果正确。2.利用脂质体将各重组质粒和对照pGL3-521质粒分别转染雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP,检测荧光素酶报道基因的表达活性,观察内含子及5′上游10 kb调控区对NKX3.1启动子活性的影响。结果显示:NKX3.1基因5′上游调控区第7号片段（-7681～-6483bp）可以明显升高NKX3.1启动子活性,表明此区域可能存在正调控元件,其他各区域未发现明显的正调控作用。3.NKX3.1是受雄激素调节的基因,为了观察内含子及5′上游10 kb调控区是否受雄激素调节,用雄激素类似物R1881分别处理pGL3-521、pGL3in-521、pGL31-521至pCL310-521转染的雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP,检测荧光素酶活性,同时转染受雄激素调节的含前列腺特异性抗原（PSA）上游6 kb调控区的质粒pGL3-PSA作为阳性对照。结果显示:LNCaP细胞转染质粒后,加R1881处理24 h,PSA的启动子活性明显增强,而NKX3.1的内含子及10段5′上游10 kb调控区没有明显的雄激素反应性。4.NKX3.1是前列腺特异表达的基因,为检测第7号片段是否含前列腺特异性的增强元件,将pGL37-521及对照pGL3-521分别转染不同的肿瘤细胞株,检测其荧光素酶活性。结果显示:第7号片段在各细胞株中对NKX3.1启动子均有增强作用。说明该片段并不具备组织特异性。5.进一步对5′上游调控区第7号片段内的正调控元件及其结合蛋白进行研究鉴定。采用5′缺失突变技术,对其进行较大范围的5′系列缺失,构建一系列pGL37-521缺失突变体,分别转染前列腺癌细胞株LNCaP,测定荧光素酶表达活性。结果显示:系列缺失至-6658 bp对pGL37-521的活性没有明显影响,-6658～-6483 bp的片段仍可使NKX3.1启动子活性明显升高,表明正调控元件可能存在于该区域。继续采用5′缺失突变技术,进一步对该区域进行较小范围的缺失突变,限定其序列范围。缺失突变分析结果显示:-6658～-6548bp的缺失对pGL37-521的活性无明显影响,而-6548～-6505 bp的缺失可使其活性明显降低,说明此44 bp序列可能是一个正调控元件。人工合成44 bp的调控序列,分别插入到同源和异源启动子上游,检测其对同源和异源启动子的影响。结果显示44 bp调控序列对同源和异源启动子均有增强作用。进一步用雄激素类似物R1881刺激转染了44 bp重组质粒的LNCaP细胞,检测雄激素对44 bp序列正调控作用的影响,结果显示44 bp调控序列并不具备雄激素反应性。采用电泳迁移率改变实验（EMSA）检测44 bp序列的结合蛋白。结果在LNCaP细胞核提取液中检测到与44 bp序列特异结合的蛋白,说明该44 bp序列为功能性正调控元件。结论:1.克隆了NKX3.1基因521 bp启动子区、内含子并分10段克隆了NKX3.1,基因5′上游-10641～-474 bp的10 kb调控区。2.通过荧光素酶报告基因分析,NKX3.1基因5′上游-7681～-6483 bp可以增强NKX3.1启动子活性,分析显示NKX3.1组织特异性增强元件并不存在于该片段。内含子及5′上游10 kb其他区域对NKX3.1启动子活性未见明显的增强作用。3.进一步分析证明-6548～-6505 bp区域存在一个44 bp的功能性正调控元件,在前列腺癌细胞株LNCaP核提取液中检测到与其特异结合的蛋白质。4.NKX3.1基因内含子及5′上游10 kb调控区不具备雄激素反应性。第二部分Sp1过表达对人同源盒基因NKX3.1的增强作用及其作用元件的鉴定研究目的:本部分实验研究了Sp1对人同源盒基因NKX3.1基因的作用并鉴定了其作用元件,为进一步研究NKX3.1的基因表达调控奠定基础。研究方法和结果:1.利用脂质体将不同浓度的Sp1表达载体（pCMV-Sp1）转染前列腺癌细胞株LNCaP,分别收集细胞RNA及总蛋白。通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）特异性扩增NKX3.1及Sp1检测其mRNA的表达;通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）检测NKX3.1蛋白的表达情况。观察Sp1过表达对NKX3.1表达的影响。结果显示:随着Sp1表达载体浓度的增加,Sp1 mRNA、NKX3.1 mRNA及NKX3.1蛋白表达均增强。表明Sp1过表达可以增强NKX3.1的表达并且该增强作用呈剂量依赖性。2.本实验室前期工作已经构建了含有NKX3.1基本启动子活性的荧光素酶报道基因质粒pGL3-521。利用脂质体将pGL3-521与不同浓度的pCMV-Sp1共转染LNCaP细胞,并检测荧光素酶报道基因的表达活性,观察Sp1过表达对NKX3.1启动子活性的影响。双荧光素酶活性检测结果显示:Sp1过表达可以增强NKX3.1启动子活性并且该增强作用呈剂量依赖性。3.Transfac数据库分析NKX3.1基因上游序列,发现在+29～+43 bp、+9～+23 bp和-60～-46 bp存在Sp1元件的同源性序列,分别命名为Sp1a、Sp1b和Sp1c。采用核酸缺失突变技术,对Sp1a、Sp1b和Sp1c逐步进行缺失突变,构建缺失突变体,利用脂质体将pGL3-521及缺失突变体分别转染LNCaP细胞,检测荧光素酶报道基因的表达活性。结果显示:逐步缺失Sp1a和Sp1c均使pGL3-521的启动子活性明显降低;而进一步缺失Sp1b,pGL3-521的启动子活性没有明显改变。表明Sp1a和Sp1C可能是功能性正调控元件。4.人工分别合成Sp1a和Sp1c正调控序列,分别插入同源或异源启动子的上游,检测Sp1a和Sp1c正调控序列对同源和异源启动子的作用。结果显示Sp1a和Sp1c正调控序列对NKX3.1启动子、SV40启动子和maspin启动子都有增强作用。5.提取前列腺癌细胞株LNCaP的核蛋白,设立特异性和非特异性竞争结合反应,采用电泳迁移率改变实验检测LNCaP细胞核提取液中Sp1a和Sp1c正调控序列的特异性结合蛋白。结果在LNCaP细胞核提取液中检测到与Sp1a和Sp1c序列特异结合的蛋白,证实Sp1a和Sp1c序列为功能性Sp1反应元件。6.采用陷阱DNA技术进一步验证Sp1a和Sp1c的功能。将不同浓度的Sp1a和/或Sp1c元件与pGL3-521或插入了Sp1a或Sp1c的SV40启动子质粒共转染LNCaP细胞,并检测荧光素酶报道基因的表达活性,观察陷阱DNA对Sp1a和Sp1c元件功能的影响。双荧光素酶活性检测结果显示:过量的Sp1a和Sp1c陷阱DNA可以抑制各启动子活性且该抑制作用呈剂量依赖性。表明Sp1a和Sp1c的陷阱DNA可以竞争性抑制Sp1a和Sp1c元件与转录因子Sp1的结合,证实Sp1a和Sp1c序列为功能性Sp1反应元件。结论:1.Sp1过表达可以增强NKX3.1的表达及其启动子活性,且该增强作用呈剂量依赖性。2.+29～+43 bp和-60～-46 bp的Sp1元件可能是功能性正调控元件。3.在前列腺癌细胞株LNCaP核蛋白提取液中检测到与+29～+43 bp和-60～-46 bp的Sp1元件特异结合的蛋白质,证实Sp1a和Sp1c序列为功能性Sp1反应元件。4.过量的Sp1陷阱DNA可以抑制Sp1a和Sp1c正调控元件的功能且该抑制作用呈剂量依赖性。第三部分p53及姜黄素抑制雄激素受体对人同源盒基因NKX3.1的转录激活作用及其机制研究研究目的:研究抑癌基因p53、姜黄素对人同源盒基因NKX3.1的作用及其机制,为进一步研究AR途径对NKX3.1的基因表达调控的作用及NKX3.1在前列腺发育及肿瘤发生发展中的作用奠定基础。研究方法和结果:1.为了观察抑癌基因p53对NKX3.1表达的影响,利用脂质体将不同浓度的p53野生型表达载体（pCMV-p53wt）转染雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP促进外源性p53的表达,利用紫外线照射LNCaP细胞促进内源性p53的表达;为了观察姜黄素对NKX3.1表达的影响,用不同浓度的姜黄素处理LNCaP细胞。分别收集处理后的LNCaP细胞RNA和蛋白质。利用RT-PCR和Western blot技术分别检测p53和姜黄素在mRNA水平和蛋白水平对NKX3.1表达的影响。结果显示:外源性和内源性p53过表达或姜黄素处理LNCaP细胞均可以抑制NKX3.1 mRNA及蛋白的表达,且该抑制作用呈剂量依赖性。2.p53的表达可以促进其下游靶基因p21的表达进而导致细胞周期停滞,从而抑制细胞生长。为检测p53是否通过p53-p21途径下调NKX3.1,利用脂质体将p21表达载体（pPSA-p21）转染LNCaP细胞,利用RT-PCR和Western blot检测p21过表达对NKX3.1表达的影响。结果显示:p21的过表达对NKX3.1的表达没有明显影响。表明p53对NKX3.1的表达抑制并非是通过p53-p21途径介导的细胞生长抑制的结果。3.NKX3.1是受雄激素调节的基因。为了检测p53是否通过AR途径抑制NKX3.1的表达,利用脂质体将AR表达载体（pSG5-hAR）与pCMV-p53wt共转染LNCaP细胞,并加入终浓度为10-8M的雄激素类似物R1881刺激细胞。收集细胞RNA和蛋白质,通过RT-PCR和Western blot检测NKX3.1的表达情况。结果显示:p53过表达可以抑制NKX3.1在mRNA水平和蛋白水平的表达,而AR的过表达可以缓解p53对NKX3.1表达的抑制作用。说明p53对NKX3.1表达的抑制作用可能是通过AR途径发挥作用。4.为了检测姜黄素是否通过AR途径抑制NKX3.1的表达,用姜黄素处理LNCaP细胞12h后,加入终浓度为10-8M的R1881或AR拮抗剂氟他胺处理细胞,继续培养12h后收集细胞总蛋白,通过Western blot检测NKX3.1的表达情况。结果显示:在没有姜黄素处理的细胞中,R1881可以促进NKX3.1的表达而氟他胺抑制NKX3.1的表达。加入姜黄素处理细胞后,NKX3.1的表达明显降低,且加入R1881对NKX3.1的表达没有明显的增强作用,加入氟他胺后,NKX3.1的表达进一步降低。说明NKX3.1的表达部分依赖于AR信号通路,而姜黄素可以抑制雄激素和AR介导的NKX3.1的表达。5.为进一步研究AR在p53和姜黄素抑制NKX3.1过程中的作用,利用脂质体将AR启动子（pGL3-AR）和不同浓度的pCMV-p53wt共转染LNCaP细胞或者利用脂质体将pGL3-AR转染LNCaP细胞后用不同浓度的姜黄素处理LNCaP细胞,检测其荧光素酶活性。结果显示:p53和姜黄素均可以抑制AR的启动子活性,并且其抑制作用呈剂量依赖性。利用脂质体将不同浓度的pCMV-p53wt转染LNCaP细胞或用不同浓度的姜黄素处理LNCaP细胞后,分别收集细胞RNA和总蛋白,利用RT-PCR和Western blot技术检测p53和姜黄素对AR表达的影响。结果显示:p53和姜黄素可以剂量依赖性的抑制AR的mRNA及蛋白的表达。6.采用电泳迁移率改变实验检测p53及姜黄素是否可以影响AR的功能,即AR与雄激素受体反应元件（ARE）的结合能力。利用脂质体将不同浓度的pCMV-p53wt转染LNCaP细胞或利用不同浓度的姜黄素处理LNCaP细胞。提取细胞核蛋白,将其与地高辛标记的ARE探针进行结合反应,并设立特异性或非特异性竞争结合反应,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测电泳迁移率的改变。结果显示:在未转染pCMV-p53wt或未加入姜黄素处理的LNCaP核蛋白提取液中检测到与ARE元件特异结合的蛋白。转染pCMV-p53wt的LNCaP核蛋白提取液中检测不到与ARE元件特异结合的蛋白;加入姜黄素处理的细胞核提取液中AR与ARE的特异性结合可以被姜黄素剂量依赖性的抑制。表明p53及姜黄素均可以通过阻断AR与DNA的结合从而发挥对下游靶基因NKX3.1的抑制作用。结论:1.p53及姜黄素可以抑制NKX3.1的表达并且该抑制作用呈剂量依赖性。2.p53对KX3.1表达的抑制作用并非是p53-p21途径介导的细胞生长抑制的结果。3.p53及姜黄素可能通过抑制AR表达、阻断AR与DNA的结合从而抑制AR对人同源盒基因NKX3.1的转录激活作用。
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