生长因子诱导骨髓基质干细胞向胆碱能神经元分化及其信号转导机制研究

论文摘要

近年来,对骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）可塑性的研究进展迅速,BMSCs能够分化形成包括造血组织在内的多种组织细胞,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞,如骨、软骨、脂肪、纤维组织、上皮组织和骨髓支持基质等多种间充质组织,使人们看到了用细胞移植方法治疗神经退行性疾病的新希望。2000年Brazelton和Mezey异体移植BMSCs成功,其后才证明BMSCs可向神经细胞分化,近年来对BMSCs的促分化因子进行了大量的研究,β-巯基乙醇（beta-mercaptoethanol, BME）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、4-羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole, BHA）、五氮杂胞苷（5-azacytidine）、维甲酸（retinoic acid, RA）等相继被证实可以诱导BMSCs分化为神经元样细胞。一些生长因子如表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor, BDNF）,和视黄酸、胎鼠中脑或纹状体细胞悬液共同作用后,在体外也成功诱导成年大鼠和人的BMSCs分化为幼稚的神经元和胶质细胞。BMSCs还可被诱导分化为特征类型的神经元,如5-HT敏感神经元,多巴胺能神经元,但胆碱能神经元的分化一直是个难题。BMSCs分化为神经细胞的机制十分复杂,除了表达中胚层mRNA以外,还表达生殖细胞以及内、外胚层基因。其向神经元的分化受神经特异性基因表达量的调控,而并非由相应基因表达的开放与关闭控制。Sox、Pax、Notch、delta、frizzled、erbB基因以及RB、RB2/P130基因在BMSCs分化中起重要作用,最新研究表明其分化和MAPK信号通路有关。虽然有关BMSCs分化为神经元的研究进展迅速,但仍有很多问题未得到解决:首先,诱导骨髓基质干细胞分化为神经元的方案中,都存在一些缺陷,如由于化学诱导剂的毒性而不适合临床应用,某些生长因子虽然能诱导分化,但不能定向分化为特定类型等。虽然诱导BMSCs分化为多巴胺能神经元和5-HT敏感神经元已经成功,但向胆碱能神经元的分化至今未见报道。其次,诱导分化的机理研究尚不充分,尤其是分化信号的转导过程不明。以往的研究提示,在不同的细胞类型中,同一个信号传递过程可能表现出截然相反的结果,尤其是PI3K-Akt-mTOR通路和MAPK通路在BMSCs向神经元分化过程中的作用,仅见两篇报道。另外,细胞分化过程涉及到结构重建、细胞器重组、凋亡和自噬等复杂的过程,但与BMSCs向神经分化相关的自噬研究尚属空白,针对上述问题,本课题开展了一系列的研究。研究目的:筛选建立生长因子体外诱导BMSCs分化为胆碱能神经元的有效方法;通过采用特异性抑制剂,观察生长因子诱导BMSCs向胆碱能神经元分化的分化率和生存率的变化;通过检测PI3K-Akt-mTOR通路和MAPK通路蛋白以及p53表达和自噬水平的改变,初步阐明生长因子诱导BMSCs分化的信号转导机制。研究方法:（1）建立BMSCs培养和扩增方法,用不同浓度NGF诱导BMSCs分化,光镜观察分化细胞情况,从中筛选出合适的浓度;用NGF、NGF+bFGF和NGF+EGF+bFGF三种处理方式诱导BMSCs,光镜观察分化情况,免疫荧光鉴定MAP-2表达,以筛选有效组合;（2）用LY294002抑制PI3K活性,光镜观察其对生长因子诱导分化的影响,免疫荧光鉴定MAP-2和ChAT表达并计算ChAT阳性细胞率,MTT法测定分化细胞死亡率;（3）Western blot检测生长因子单独诱导、LY294002单独作用和两者共同作用时Akt、ERK激活的变化,p53表达量的变化,以及Cathepsin-B、LC3检测自噬水平,结合ChAT阳性细胞率,细胞生存率的结果,分析诱导分化的信号传导机制。实验结果:（1）NGF 100 ng/mL有很好的诱导分化作用,NGF+EGF+bFGF联合应用能诱导BMSCs分化为ChAT阳性神经细胞,分化率达6070%。ChAT阳性细胞率有一定的时间相关性,诱导后3 h、5 h明显高于1 h,但3 h后阳性率不再升高（P>0.05,与5 h相比）;单纯抑制PI3K（LY294002组）也能诱导BMSCs分化为ChAT阳性细胞,然而其阳性细胞率在每一个时间点都明显低于生长因子诱导组;在生长因子与LY294002联合处理组,ChAT阳性细胞率明显高于单纯生长因子组。（2）生长因子诱导BMSCs分化为ChAT阳性神经元后,随着时间延长细胞生存率并无明显下降,PI3K抑制使分化细胞大量死亡,生存率降低,并明显抑制生长因子诱导BMSCs分化的胆碱能神经元的生存率。（3）生长因子诱导BMSCs分化后,Akt磷酸化蛋白显著增多并持续至5 h;抑制PI3K活性后,Akt有一定的磷酸化激活,但5 h后显著下降,与对照组相比已无差别。LY294002阻断PI3K活性后,生长因子对Akt的磷酸化水平在处理后1 h没有明显改变,3 h后磷酸化水平明显增高,至5 h后仍然维持在高水平。（4）生长因子诱导后1 h ERK1/2明显激活,显著高于对照组,3 h和5 h后明显下降,PI3K抑制可明显阻滞ERK1/2的激活,但与生长因子联合作用后1 h,可增加ERK1/2的水平,3h、5h则明显低于未抑制组。（5）生长因子诱导分化后,p53表达上调,PI3K抑制后p53表达量进一步增加,同时生长因子可明显降低BMSCs诱导分化后的自噬水平,并与PI3K抑制有协同作用。结论:1.首次发现NGF、EGF和bFGF联合处理可有效诱导BMSCs分化为ChAT阳性的胆碱能神经元。2.生长因子通过激活Akt诱导BMSCs分化为胆碱能神经元,Akt激活需至一定水平才能诱导分化,存在一个“诱导阈值”。3. ERK1/2的激活是分化细胞生存的重要条件之一,高度激活的Akt诱导信号可引起ERK1/2的激活抑制,从而降低分化细胞的生存率,两者之间的平衡可维持分化神经元的高生存率。4. p53表达上调不是降低由BMSCs分化的胆碱能神经元生存率的主要因素,但可以协同ERK1/2激活抑制所致的分化细胞的生存率降低。自噬可能不参与诱导BMSCs向胆碱能神经元的分化过程。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 一、骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究现状
• 二、骨髓基质干细胞分化为神经元的可能机制
• 三、PI3K- Akt-mTOR 信号通路在细胞分化中的作用
• 四、MAPK（mitogen activated protein kinase, 丝裂原活化蛋白激酶）信号转导 途径及其功能
• 五、p53 途径与 Akt 和 MAPK 通路的关系及对分化的作用
• 六、自噬（Autophagy）与细胞内信号通路的相互作用
• 七、目前研究存在的问题
• 八、研究目标和意义
• 参考文献
• 第一部分 大鼠骨髓基质细胞培养及向神经元诱导分化的方法筛选
• 第一节 骨髓基质干细胞的原代培养、传代和鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 BMSCs 诱导分化为神经元的方法筛选
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 联合诱导BMSCs 向胆碱能神经元的分化及抑制P13K 对分化的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 信号通路蛋白在BMSCs 诱导分化为胆碱能神经元过程中的机制
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 学位论文结论
• 综述
• 中英文词语对照及缩略词表
• 今后研究工作设想
• 攻读博士学位以来发表论文、科研成果及获奖
• 致谢