养殖底泥和农用土壤抗生素抗性组学研究

论文摘要

抗生素抗性问题已成为当前国际上的研究热点之一。抗生素的长期滥用使动物和人体内形成大量的抗性菌株，经排泄后抗性菌株携带的抗性基因也随之进入环境；另一方面，水产、养殖、医疗等行业使用的抗生素经排放后使得环境中抗生素浓度升高，也导致环境抗生素抗性基因数量增加，种类变多。抗生素抗性基因具有很高的迁移性和活性，可以通过基因的水平转移在环境中传播，是一类新型的环境污染物。为了研究环境中的抗性基因，采集清水灌溉、污水灌溉的水稻土和养虾池底泥，分别提取上述三个环境样品的总DNA，构建宏基因组文库。获得的克隆子用14种抗生素进行抗性筛选，将表达抗性的克隆子进行测序，所得序列首先用NCBI中的ORF Finder软件查找开放阅读框，之后通过BLAST和系统进化树分析可能的抗性基因。通过抗生素抗性筛选，得到28个抗性克隆子：其中11个表达对二甲胺四环素（Min）的抗性，8个表达对四环素（Tet）的抗性，4个表达对卡那霉素（Kan）的抗性，2个表达对利福平（Rif）的抗性，各有1个表达对土霉素（Oxy）、链霉素（Str）、氯霉素（Chl）的抗性。对抗性克隆子插入序列进行分析的结果表明：不同类抗生素的抗性机制和抗性基因各不相同：（1）细菌对氨基糖苷类药物的抗性多与修饰酶的产生有关。本实验筛选到5个氨基糖苷类抗生素抗性基因，其中，4个基因的产物与氨基糖苷乙酰转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶以及氨基糖苷核苷转移酶最相似，另有1个基因的产物与外排蛋白最相似。（2）筛选到的四环素类抗生素抗性基因与已报道的的抗性基因在氨基酸水平上的相似性极低，其中，5个基因编码的产物与外排蛋白最相似，4个基因编码的产物与修饰酶最相似，5个基因的产物与DNA合成、转录或翻译相关的蛋白最相似，6个克隆子包含的ORFs的产物与未知功能的蛋白最相似。编码四环素修饰酶的抗性基因在之前的报道中并不多见，本实验的结果表明目前的研究可能低估了此种抗性基因的存在。（3）筛选到1个Chl抗性基因，其编码的产物与主动外排系统TonB最相似，相似性仅为43%。氯霉素抗性常见的机制为产生乙酰基转移酶，本实验未发现编码乙酰基转移酶的基因可能是由于受到异源表达的限制。（4）筛选到2个Rif抗性基因，其编码的产物与ADP-核糖基转移酶、ABC转运器相关蛋白最相似。本实验筛选到的抗性基因，其编码的产物多数与已知氨基酸序列相似性较低，约有60%的抗性基因对应的氨基酸序列与已知氨基酸序列的最大相似性小于65%，为新的抗性基因。一方面说明环境是抗性基因巨大的储库，我们应扩大抗性组的研究范围，探索环境系统中抗性基因的多样性和进化关系，深入研究抗性基因的抗性机制，促进新一代抗菌药物的研发；另一方面也说明抗性组学的方法可以用来研究环境中的抗性基因，并可以从未培养微生物中获得大量新的抗性基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 抗生素抗性
• 1.2 抗生素抗性机制
• 1.3 抗生素抗性基因（ARGS）—一种新型环境污染物
• 1.4 抗生素抗性组的内涵及研究意义
• 1.5 抗生素抗性组学研究进展
• 1.6 抗性组学研究展望
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第2章 实验材料
• 2.1 样品来源及处理
• 2.2 菌株与质粒
• 2.3 溶液、缓冲液和试剂
• 2.4 培养基和抗生素
• 2.5 实验仪器
• 第3章 实验流程及方法
• 3.1 实验流程图
• 3.2 测农用土壤和养殖底泥理化性质
• 3.3 质粒 DNA 的制备
• 3.4 质粒 DNA 的酶切
• 3.5 质粒 DNA 酶切片段的分离与回收
• 3.6 质粒 DNA 的去磷酸化
• 3.7 质粒 DNA 浓度的测定
• 3.7.1 试剂准备
• 3.7.2 标准品工作液稀释
• 3.7.3 制备标准曲线
• 3.7.4 样品分析
• 3.8 环境样品总 DNA 的提取
• 3.9 环境样品 DNA 不完全酶切
• 3.10 环境样品 DNA 酶切产物的分离与回收
• 3.11 环境样品 DNA 酶切产物的浓度测定
• 3.12 质粒与 DNA 片段的连接
• 3.13 连接产物的转化
• 3.13.1 制备电转化的感受态
• 3.13.2 电击转化
• 3.14 文库评价
• 3.15 文库的扩增与保存
• 3.16 抗性克隆筛选
• 3.16.1 微量稀释法测定宿主菌最低抑制浓度
• 3.16.2 文库的扩增
• 3.16.3 文库的筛选
• 3.16.4 菌落 PCR 验证
• 3.16.5 RFLP 分析
• 3.16.6 测序及序列分析
• 3.16.7 抗性克隆子保存
• 第4章 结果
• 4.1 农用土壤和养殖底泥理化性质
• 4.2 宏基因组文库的构建
• 4.2.1 样品总 DNA 的提取与酶切
• 4.2.2 酶切后样品 DNA 与质粒 DNA 浓度的测定
• 4.2.3 文库的构建
• 4.2.4 文库的评价
• 4.3 克隆文库的筛选
• 4.3.1 测定抗生素的最低抑制浓度
• 4.3.2 文库筛选的结果
• 第5章 讨论
• 5.1 氨基糖苷类抗生素抗性基因
• 5.2 四环素类抗生素抗性基因
• 5.3 氯霉素抗性基因
• 5.4 利福平抗性基因
• 5.5 抗性组学方法的优缺点
• 5.5.1 抗性组学方法的优点
• 5.5.2 抗性组学方法的缺点
• 5.6 文库构建方法比较
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文