永生化胎猪胰腺源间充质干细胞株的建立及向胰岛素分泌细胞分化

论文摘要

糖尿病是继心血管疾病和癌症之后的第三大高发慢性疾病,它还会导致多种并发症的发生,如眼疾、肾脏疾病、神经系统疾病、心脑血管疾病及糖尿病高渗综合症等。猪胰岛因组织来源丰富,胰岛素结构与人相似,且能在人体血清内存活发挥特定的生理性血糖调节作用,可以作为新的可替代的供体细胞来源。但是胰腺内胰腺干细胞的数量相对较少,而且该细胞长期处于生长阻滞期,这样胰腺干细胞的增殖能力受到了极大的限制。本研究旨在通过酶消化胎猪胰腺组织分离出胰岛样细胞团,单克隆扩增出间充质干细胞,进一步转染人的端粒酶基因获得永生化胎猪胰腺源间充质干细胞株,对该细胞株进行生物学特性检测,判断其是否具有胰腺干细胞的相关特性,能否用于糖尿病胰岛β细胞受损的替代治疗。1.永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的分离培养及生物学特性本研究采用先悬浮后贴壁的方法从2.53月龄胎猪胰腺组织中分离出间充质干细胞,转染hTERT,单克隆出永生化胎猪胰腺源间充质质干细胞株,体外多次传代后仍然保持很强的增殖活力（100代以上）,通过细胞生长曲线的绘制、流式细胞仪分析表面抗原、免疫荧光/组化染色、RT-PCR检测、成瘤性检测以及体外可定向诱导分化等方法,对该细胞的生物学特性进行了系统鉴定,证明其具有经典间充质干细胞和部分胚胎干细胞的生物学特性,并具有定向分化为类神经、心肌和生殖细胞的潜力,将其移植入裸鼠体内未观察到成瘤现象。2.永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化建立了一个体外两步法向胰岛素分泌细胞定向分化的诱导分化方案,第一步:添加10 mmol/L尼克酰胺、100 ng/mL ActivinA、20 ng/L EGF和20 ng/L bFGF的方法先贴壁诱导4 d,随后将其移至低粘附性培养皿中继续诱导3 d;第二步:撤去EGF和bFGF,添加10 nmol/L Exendin4和4 nmol/Lβ-细胞素（BTC）,继续悬浮诱导1 w,将永生化胎猪胰腺源间充质干细胞诱导成胰岛样细胞团。诱导后的细胞团呈DTZ、PDX1、Insulin、C-peptide阳性。高低糖刺激后,诱导的细胞具有良好的葡萄糖反应性,能够分泌胰岛素和C-肽。通过注射STZ的方法,建立小鼠糖尿病模型,将诱导后的细胞移植入糖尿病模型小鼠体内后,可2 w内缓解糖尿病模型小鼠的高血糖状况。将永生化胎猪胰腺源间充质干细胞移植入小鼠睾丸,切片染色检测发现该细胞可以在体内自发分化为生殖细胞和在高糖状况下自发分化为胰岛素分泌细胞。3. GSK3抑制剂-BIO调控永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的增殖体外添加BIO后,通过免疫荧光染色、QRT-PCR检测、Western-blotting、荧光素酶活性分析、BrdU增殖分析及细胞凋亡（Tunel染色分析）,初步认为永生化胎猪胰腺源间充质干细胞通过Wnt/β-catenin信号通路能够促进其增殖,但通过QRT-PCR检测和葡萄糖刺激反应等实验证实BIO在该细胞向胰岛素分泌细胞分化的过程中无显著效用,因而认为BIO能够促进永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的增殖并保持其未分化的状态。上述结果表明,永生化胎猪胰腺源间充质干细胞具有很强的体外增殖能力,体外能够向其他类型细胞进行分化,可以为组织工程和再生医学的研究提供足够的细胞资源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 胰腺干细胞的研究进展及移植治疗糖尿病
• 1.1 糖尿病及其治疗
• 1.1.1 糖尿病
• 1.1.2 糖尿病的主要治疗方法
• 1.1.2.1 胰岛素的注射
• 1.1.2.2 胰腺及胰岛的移植
• 1.1.2.3 细胞移植治疗
• 1.2 胰腺干细胞的研究进展
• 1.2.1 胰腺发育
• 1.2.2 胰腺发育过程中相关分子调控
• 1.2.2.1 PDX1
• 1.2.2.2 Ptf1a
• 1.2.2.3 Hb
• 1.2.2.4 Ngn3
• 1.2.2.5 NeuroD1
• 1.2.2.6 Is11
• 1.2.2.7 Pax6
• 1.2.2.8 Nkx2.2
• 1.2.2.9 Nkx6.1
• 1.2.2.10 MafA
• 1.2.3 胰腺干细胞的来源
• 1.2.3.1 胰腺干细胞来源于胰腺导管
• 1.2.3.2 胰腺干细胞来源于胰岛
• 1.2.3.3 胰腺干细胞来源于腺泡
• 1.2.4 胰腺干细胞的分离培养
• 1.2.4.1 取材
• 1.2.4.2 分离纯化
• 1.2.4.3 培养
• 1.2.5 向β细胞定向诱导分化
• 1.2.5.1 向β细胞定向分化的相关方案
• 1.2.5.2 向β细胞分化的相关信号通路
• 1.3 小结与展望
• 实验研究
• 第二章 永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的分离培养与生物学特性鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.1.5 胎猪胰腺组织的分离
• 2.1.6 胎猪胰腺源间充质干细胞的分离与培养
• 2.1.7 胎猪胰腺源间充质干细胞转染hTERT 基因
• 2.1.8 细胞生长曲线的绘制及群体倍增时间的计算
• 2.1.9 流式细胞仪分析细胞表面抗原
• 2.1.10 免疫荧光/组织化学染色
• 2.1.11 RT-PCR
• 2.1.12 致瘤性检测
• 2.1.13 体外向神经细胞诱导分化
• 2.1.14 体外向心肌细胞诱导分化
• 2.1.15 体外向生殖细胞诱导分化
• 2.2 结果
• 2.2.1 胎猪胰腺源细胞团的分离、培养
• 2.2.2 胎猪胰腺源间充质样细胞转染hTERT
• 2.2.3 细胞生长特性
• 2.2.4 永生化胎猪胰腺源间充质细胞表达的特征性标记
• 2.2.4.1 胰腺细胞相关标记检测
• 2.2.4.2 细胞表面抗原标记检测
• 2.2.4.3 细胞多能性标记检测
• 2.2.5 致瘤性检测
• 2.2.6 体外分化潜能的检测
• 2.2.6.1 向神经细胞定向诱导分化
• 2.2.6.2 向心肌细胞定向诱导分化
• 2.2.6.3 向生殖细胞定向诱导分化
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要试剂配制
• 3.1.4 实验动物
• 3.1.5 永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞定向诱导分化
• 3.1.6 双硫腙染色和免疫荧光染色
• 3.1.7 QRT-PCR
• 3.1.8 Western-blotting 检测
• 3.1.9 葡萄糖刺激试验
• 3.1.10 诱导后的细胞团移植治疗小鼠糖尿病
• 3.1.10.1 小鼠糖尿病模型的建立
• 3.1.10.2 细胞移植
• 3.1.10.3 细胞移植治疗效果评估
• 3.1.11 体内自发分化潜能
• 3.1.12 数据处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 DTZ 染色
• 3.2.2 免疫荧光染色
• 3.2.3 RT-PCR 和QRT-PCR 检测
• 3.2.4 Western-blotting 检测
• 3.2.5 葡萄糖刺激试验检测
• 3.2.6 模型鼠体重监测结果
• 3.2.7 血糖监测结果
• 3.2.8 移植细胞的标记
• 3.2.9 永生化胎猪胰腺源间充质干细胞在体内自发向生殖细胞分化
• 3.2.10 永生化胎猪胰腺源间充质干细胞在体内自发向胰岛细胞团分化
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 GSK3 抑制剂-BIO 调控永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的增殖
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 BIO 对永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的体外增殖的影响
• 4.1.3.1 生长曲线的绘制
• 4.1.3.2 免疫荧光染色检测
• 4.1.3.3 RT-PCR 和QRT-PCR 检测
• 4.1.3.4 Western-blotting 检测
• 4.1.3.5 BrdU 增殖分析
• 4.1.3.6 荧光素酶活性分析
• 4.1.3.7 细胞凋亡检测（Tunel）
• 4.1.4 BIO 对永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响
• 4.1.4.1 体外永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化
• 4.1.4.2 免疫荧光检测
• 4.1.4.3 QRT-PCR 检测
• 4.1.4.4 葡萄糖刺激试验
• 4.1.5 数据处理
• 4.2 结果
• 4.2.1 BIO 能够促进永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的自我更新
• 4.2.1.1 形态学观察
• 4.2.1.2 筛选出BIO 的最佳浓度
• 4.2.1.3 细胞生长特性
• 4.2.1.4 免疫荧光染色结果
• 4.2.1.5 QRT-PCR 检测
• 4.2.1.6 RT-PCR 检测
• 4.2.1.7 Western-blotting 检测
• 4.2.1.8 β-catenin 激活分析
• 4.2.1.9 BrdU 增殖分析
• 4.2.1.10 Tunel 染色分析
• 4.2.1.11 E-cadherin 表达分析
• 4.2.2 BIO 对永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化影响
• 4.2.2.1 免疫荧光染色分析
• 4.2.2.2 QRT-PCR 分析
• 4.2.2.3 葡萄糖刺激试验检测
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 本研究的创新点与进一步研究的课题
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介