拟南芥雄性不育基因APAM2和APAM3的鉴定及表达模式研究

论文摘要

高等植物雄配子的发育是一个复杂的过程,雄配子体的发育过程在拟南芥中研究较为清楚。已有的研究表明,参与拟南芥雄配子体发育相关的基因数量非常庞大,约有3500个基因在花粉发育过程中表达,其中1400可能在花粉中特异表达或高水平表达。只有少部分基因的功能得到了研究,其原因是突变基因无法通过雄配子体传递给下一代,因此对突变基因功能的分析也十分困难。利用基因陷阱技术,分离到两个Ds插入的雄性不育突变体+/apam2,+/apam3,通过正反交实验这两个突变体由于花粉发育不正常而导致雄性不育。本实验室对这两个突变体进行了表型的观察。同时,利用TAIL-PCR技术定位了这两个突变的基因,分别对应的是At3g50590基因和At2g37690基因。突变体互补分析实验证明,At3g50590和At2g37690基因全长能够很好的互补突变体apam2,apam3的表型。本论文在这些结论的基础上进行了如下研究。将+/apam2,+/apam3分别与qrtl纯合突变体杂交得到+/apam-qrtl和+/apam3-qrtl两个双突变体,发现这两个双突变体四连体花粉中有两个异形的花粉粒,体外萌发实验发现这两个异形的花粉粒不能萌发。RT-PCR实验证明了这两个基因在拟南芥孢子体和配子体组织中都有表达。且GUS组织定位也佐证了这两个基因为广泛表达的基因。通过对突变体进行番红-固绿石蜡切片观察,发现两个突变体在花粉囊发育晚期能观察到花粉异形。其中+/apam2突变体在花粉囊发育的第11期以前小孢子在形态上都正常,花粉囊也无异常。+.apam3突变体在花粉囊发育的第11期就开始出现一部分不正常的小孢子,暗示了这两个基因可能参与小孢子后期成熟过程。为了研究基因在孢子体中的功能,我们利用拟南芥Lensberg erecta野生型花粉的cDNA库扩增到基因At3g50590和At2g37690的cDNA片段。通过构建APAM3超表达载体（CaMV35S promoter::At2g37690cDNA）发现该基因在植株中过量表达并不会产生与野生型有明显差异的表型。同时,我们还构建了APAM3花粉互补载体（花粉特异启动子：：At2g37690 cDNA）,结果未能筛选到纯合的转基因植株,说明很可能该基因在孢子体早期发育过程中十分重要。因而,该基因配子体型突变体的纯合体植株在发育早期就已经死亡。通过生物信息学的预测,我们可知APAM3基因编码的蛋白质是催化拟南芥嘌呤从头合成第6步的AIR （Phosphoribosylaminoimidazole）羧化酶,含有两个催化活性中心PurK和PurE。APAM2基因编码一个未知WD40蛋白,含有三个WD40重复区域和异戊烯转移酶结构域。目前,还没有发现与其同源的己知蛋白,只有几个未知蛋白与其在蛋白序列上具有很强的相似性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 第1章 文献综述
• 1.1 拟南芥雄配子体的发育
• 1.1.1 拟南芥雄蕊的发育过程
• 1.1.2 拟南芥花粉囊发育的细胞生物学过程
• 1.2 参与拟南芥雄配子体发育的基因
• 1.2.1 参与早期雄蕊发生和细胞分化的基因
• 1.2.2 参与小孢子和绒毡层正常发育的基因
• 1.3 参与拟南芥雄配子体发育的基因的研究展望
• 1.4 WD40蛋白在拟南芥中的研究
• 1.5 拟南芥嘌呤从头合成过程的研究
• 1.6 本实验研究的目的和意义
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 工具酶和其他试剂
• 2.2 实验仪器
• 2.3 主要培养基配方
• 2.3.1 拟南芥种子萌发培养基
• 2.3.2 细菌培养基配方
• 2.3.3 液体花粉萌发培养基配方
• 2.4 主要试剂配制
• 2.4.1 植物培养所需试剂配制
• 2.4.2 GUS染液配方
• 2.4.3 制作番红-固绿切片所需试剂配制
• 2.4.4 CTAB法提取RNA所需试剂配制
• 2.4.5 质粒提取试剂配制
• 2.4.6 RNaseA水的配制
• 2.4.7 电泳所需试剂配制
• 2.4.8 大肠杆菌感受态制备所需试剂
• 2.4.9 大量提取植物DNA所需试剂
• 2.4.10 小量提取植物DNA所需试剂
• 2.4.11 大肠杆菌感受态细胞制备所需试剂
• 2.5 常用分子生物学实验方法
• 2.5.1 质粒提取
• 2.5.2 电泳检测
• 2.5.3 小分子DNA凝胶回收
• 2.5.4 扩增片段连接T载体
• 2.5.5 片段与载体的连接
• 2.5.6 大肠杆菌感受态的制备
• 2.5.7 热激转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.5.8 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.5.9 电击转化农杆菌感受态细胞
• 2.5.10 农杆菌介导转化拟南芥植株
• 2.6 实验方法
• 2.6.1 植物培养与生长条件
• 2.6.2 植物杂交:去雄和授粉
• 2.6.3 花粉形态的四分体分析和体外萌发
• 2.6.4 Southern blot
• 2.6.5 RNA提取及RT-PCR分析基因的表达谱
• 2.6.6 GUS染色观察基因在各组织中的表达情况
• 2.6.7 花粉囊发育的切片制作与观察
• 2.6.8 APAM2基因cDNA与APAM3基因cDNA的克隆
• 2.6.9 载体的构建与转化植物
• 2.6.10 蛋白结构功能的预测和同源基因的比对
• 第3章 实验结果分析
• 3.1 引言
• 3.2 突变体与qrt1杂交及四分体花粉体外萌发
• 3.2.1 +/apam3突变体花粉形态的四分体分析和体外萌发
• 3.2.2 +/apam2突变体花粉形态的四分体分析和体外萌发
• 3.3 突变体花粉囊的石蜡切片观察
• 3.3.1 +/apam3突变体花粉囊番红固绿-石蜡切片观察
• 3.3.2 +/apam2突变体花粉囊番红固绿-石蜡切片观察
• 3.4 RT-PCR分析突变基因表达模式
• 3.4.1 RT-PCR分析APAM3基因的表达谱
• 3.4.2 RT-PCR分析APAM2基因的表达谱
• 3.5 GUS染色分析突变基因在各组织中的表达
• 3.5.1 GUS染色观察APAM3基因在各组织中的表达
• 3.5.2 GUS染色观察APAM2基因在各组织中的表达
• 3.6 Southern blot分析apam3突变体中Ds插入拷贝数
• 3.7 APAM3基因功能的初探
• 3.7.1 引言
• 3.7.2 过表达载体的构建、植物的转化和转基因植株表型观察
• 3.7.3 APAM2基因恢复apam2花粉异形的观察与分析
• 3.8 蛋白结构域分析和功能预测
• 3.8.1 APAM3蛋白结构分析
• 3.8.2 APAM2蛋白结构分析、同源基因的比对和功能的预测
• 3.9 APAM2基因cDNA扩增
• 第4章 讨论
• 4.1 +/apam3表型分析
• 4.2 APAM3基因表达模式的研究
• 4.3 APAM3蛋白结构分析
• 4.4 APAM3基因功能的初探
• 4.4.1 过表达载体的构建、植物的转化和转基因植株表型观察
• 4.4.2 APAM3基因恢复apam3花粉异形的观察与分析
• 4.5 +/apam2表型分析
• 4.6 APAM2基因表达模式的研究
• 4.7 APAM2蛋白的预测
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 硕士期间发表的论文