过氧化氢诱导的瑞氏木霉细胞凋亡研究及原生质体细胞活力流式细胞术检测

论文摘要

瑞氏木霉（Trichoderma reesei,anamorph:Hypocrea fecorina）是一种重要的工业丝状真菌,是纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶的主要来源。可作为宿主载体表达多种外源蛋白质,具有重要的经济价值。此外瑞氏木霉作为低等多细胞真核生物,具有结构简单、生长迅速、操作简便的特点,是真菌遗传学与细胞生物学研究的理想生物材料。细胞凋亡（apoptosis）属于程序性细胞死亡（PCD）,是受到精密调控的细胞自杀过程。在高等动物中,细胞凋亡紊乱可导致多种疾病,如癌症、艾滋病等。因此细胞凋亡一直是生命科学领域的前沿与热点,并于2002年获得诺贝尔奖医学奖。目前关于酵母和丝状真菌的细胞凋亡研究正在成为生命科学新的方向。工业发酵过程中,好氧真菌瑞氏木霉时刻暴露于氧化压力（oxidativestress）下,常导致菌丝死亡,这一过程可能由细胞凋亡引起。为研究氧化压力致死机理,本文选择活性氧物质H2O2模拟氧化压力。研究表明,低浓度的H2O2可导致瑞氏木霉QM 9414原生质体细胞活力发生可逆性的下降;而较高浓度的H2O2可导致原生质体活力发生不可逆的下降,直至全部死亡。显微镜观察结果显示,2.4 mmol/L H2O2处理后的瑞氏木霉菌丝出现细胞质“起泡”及原生质体凝缩等丝状真菌细胞凋亡的表型特征。AnnexinⅤ染色证明PS外翻这一凋亡生化表型。此外,PI染色排除了细胞坏死的可能性。对于动物细胞凋亡中常见的DNA ladder现象,瑞氏木霉与其他大多数真菌中的情况类似,未发现DNA ladder。本文证明细胞凋亡机制在瑞氏木霉细胞中具有保守性。为解释发酵过程中的菌体死亡提供了新的思路。流式细胞术（Flow cytometry,FCM）是一种基于荧光的细胞生物学分析手段,能快速检测细胞群体中单个细胞的性质。在动物、植物乃至酵母细胞凋亡研究中有广泛应用。但由于菌丝形态的限制,流式细胞术在丝状真菌中应用有限。对于原生质体的检测目前尚未见报道。本文以瑞氏木霉作为研究对象,成功建立了应用流式细胞术检测丝状真菌原生质体细胞活力的方法。采用绿色荧光蛋白GFP结合PI的策略检测了不同浓度H2O2作用后的原生质体活力。其结果与荧光显微镜观察和平板计数结果完全一致。证明流式细胞术是一种有效而准确的原生质体活力鉴定方法。该研究将为丝状真菌原生质体细胞凋亡检测提供重要参考。本文证明细胞凋亡机制在瑞氏木霉中具有保守性。2.4 mmol/L H2O2可导致瑞氏木霉原生质体细胞凋亡。目前正在尝试通过转基因和基因敲除的方法阻断细胞凋亡信号通路,构建具工业生产潜力的凋亡抑制菌株。延长存活时间,提高发酵效率。此外,本文开创了利用流式细胞术检测丝状真菌原生质体活力的技术。该技术不影响原生质体活性,结合细胞分选（cell sorting）技术有望直接得到感兴趣的原生质体细胞,并再生出性状优良的菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第一章 绪论
• 1.1 细胞凋亡概述
• 1.2 酵母菌细胞凋亡
• 1.2.1 酵母细胞凋亡的证据
• 1.2.2 酵母细胞凋亡的保守性
• 1.3 丝状真菌细胞凋亡
• 1.3.1 丝状真菌细胞凋亡的保守性
• 1.3.2 丝状真菌细胞凋亡的内外源诱因
• 2O₂）'>1.4 细胞凋亡强诱导剂——过氧化氢（H₂O₂）
• 1.5 丝状真菌细胞凋亡的特征及研究方法
• 1.5.1 Annexin V染色
• 1.5.2 TUNEL染色
• 1.5.3 DNA ladder
• 1.5.4 鉴别细胞坏死与细胞凋亡
• 1.6 流式细胞术
• 1.6.1 流式细胞术概述
• 1.6.2 流式细胞术在微生物学研究中的应用
• 1.6.3 流式细胞术在丝状真菌中的应用
• 1.6.4 PI-gfp法检测细胞存活力
• 第二章 过氧化氢诱导瑞氏木霉细胞凋亡
• 2.1 材料与方法:
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基及溶液配制
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.1.5 孢子制备与计数
• 2.1.6 诱导菌丝体凋亡与生长曲线测定
• 2.1.7 制备原生质体
• 2.1.8 诱导原生质体凋亡与存活力测定
• 2.1.9 碘化丙啶染色
• 2.1.10 液氮研磨法制备染色体DNA
• 2.1.11 小量抽提法制备染色体DNA
• 2.1.12 磷脂酰丝氨酸外翻的FITC-Annexin V检测
• 2.2 实验结果和讨论
• 2O₂对菌丝生长的影响'>2.2.1 H₂O₂对菌丝生长的影响
• 2O₂对原生质体活力的影响'>2.2.2 H₂O₂对原生质体活力的影响
• 2O₂导致菌丝细胞质的凝缩以及起泡现象'>2.2.3 H₂O₂导致菌丝细胞质的凝缩以及起泡现象
• 2O₂对细胞膜完整性的影响'>2.2.4 H₂O₂对细胞膜完整性的影响
• 2O₂对染色体片断化的影响'>2.2.5 H₂O₂对染色体片断化的影响
• 2O₂对磷脂酰丝氨酸外翻的影响'>2.2.6 H₂O₂对磷脂酰丝氨酸外翻的影响
• 2.3 本章小结
• 第三章 流式细胞术检测过氧化氢处理下的瑞氏木霉细胞活力
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要设备与试剂
• 3.1.3 孢子制备与计数
• 3.1.4 制备原生质体
• 3.1.5 碘化丙啶染色
• 3.1.6 流式细胞仪检测前准备
• 3.1.7 CELLQuest程序对检测条件的设定和调整
• 3.1.8 CELLQuest程序对样品的检测
• 3.1.9 原生质体处理与CFU测定
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 流式细胞术散点图的读取
• 3.2.2 设门的策略
• 3.2.3 原生质体制备过程中菌丝碎片对检测的影响
• 3.2.4 上样缓冲液的选择
• 3.2.5 原生质体浓度的选择
• 3.2.6 流式细胞术检测原生质体活力
• 3.2.7 显微镜观察与CFU统计
• 3.3 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发（待）表的文章目录