新型生物人工肝用肝细胞保存液的实验研究

论文摘要

研究背景：我国的肝移植数每年在700例以上,1年生存率超过50%,最长存活时间超过6年。但是我国重型肝炎患者多供器官缺乏,许多患者得不到及时的肝移植手术而丧失存活机会,同时有效的供体资源也未能充分利用。因此生物人工肝与肝细胞移植等细胞水平的新治疗方法得到了研究与发展。肝细胞移植和生物人工肝支持在大量动物实验和一些临床实验中获得良好效果,成为有前途的肝病治疗途径。实际上,如果肝细胞移植及生物人工肝在临床的大量运用,肝细胞的需求量必将增加,同器官移植一样面对的供者不足的情况也将要出现。若有一实用可靠的低温储存技术,建立一个肝细胞库,危重患者随时都能得到大量高活率、有功能的肝细胞；肝细胞移植和生物人工肝技术就能普遍推广。20世纪70年代以来多种器官及组织保存方法的研究从基础理论、动物实验到临床应用都取得了重大的进展,对于器官保存中细胞和组织损伤的基本机制有了更为深入地了解,使得器官的有效保存时间明显延长,诸如UW保存液、HTK液、Celsior液等保存液的开发与应用,极大地促进了临床移植工作的开展。我国最近10多年来器官移植工作得到了飞速发展,在器官保存过程中的损伤机制以及器官保存液方面的研究也有一定的突破。但是,由于依赖进口保存液、成本高昂、不易获得,在一定程度上制约了我国器官移植的发展。这就迫切需要研制一种具有自主知识产权的低成本的新型生物人工肝用肝细胞保存液来适应生物人工肝的发展。新型生物人工肝用肝细胞保存液配方设计的特点在全面分析UW液和HTK液等多种配方的基础上,吸取国内外器官保存液的优点,遵循保存液配制的原则,Belzer等根据低温下器官的各种病理生理特点,提出了一种有效的器官低温保护液的成分,必须具备以下六个方面的特点：①减少因低温导致的细胞水肿②防止细胞的酸化作用③防止灌洗过程中的细胞间隙的肿胀④防止氧自由基的损伤,尤其在再灌注过程中⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持细胞内环境稳定。结合器官保存领域的新进展,简化改良上述两种先进保存液的成分,降低其成本,经过反复配制及验证而成。新型生物人工肝用肝细胞保存液以所含组分来源丰富,成本低,不同于既往细胞保存液,各组分有确定的成分及浓度,其主要由双糖、多聚糖、多肽、金属离子、磷酸根离子等组成,因不需要添加血清等其他异种抗原及有细胞毒性的二甲基亚砜,避免了被未知病毒污染的危险及引入异种抗原后的抗原抗体排斥反应。因而细胞在低温保存后不用经特殊处理即可以用于生物人工肝生物反应器,很好满足了临床生物人工肝要求肝细胞材料的供应快速、应急（ready-to-use）的要求。该生物人工肝用肝细胞保存液含有的基本组分是能够维持低温状态下肝细胞的活力和电解质生理浓度,其所含的组分主要是能够减轻细胞内酸化,减轻氧自由基损伤、稳定细胞膜结构、提高细胞能量、减少低温导致的细胞水肿。在配方设计上,吸收了UW液、HTK液等保存液的优点同时具备了自己明显的特点：1.具有强大的缓冲能力。选取两种缓冲对,HPO4/H2PO4及柠檬酸盐（枸橼酸盐）两种缓冲对,防止细胞在低温状态的酸化作用。2.选用非渗透性保护剂海藻糖（trehalose）,起到稳定细胞膜和蛋白质结构的作用,减轻低温状态下细胞水肿。3.添加了外源性三磷酸腺苷、氯化镁作为再生高能磷酸化合物的底物,通过ATP-Mg2+为细胞提供能量。4.采用还原型谷胱甘肽及有万能抗氧化剂之称的α-硫辛酸作为抗氧化系统及抗凋亡系统,防止或减轻细胞再灌注损伤,自由基对细胞的损伤。5.引入中药的活性成分苦参碱,利用其抗氧化性,增强保护作用。6.用羟乙基淀粉,提高胶体渗透压的方法,减轻细胞水肿。研究目的：针对现有保存液的缺陷,研制具有自主知识产权的低成本的新型生物人工肝用肝细胞保存液,并通过与UW液的比较,初步探讨其对于生物人工肝用肝细胞C3A细胞的保存效果,以及探索肝细胞保存的原理,延长肝细胞低温保存的时限,为下一步过渡到临床应用提供一定的理论和实验依据。研究方法：1.采用规范的制剂标准,按照配方配制新型生物人工肝用肝细胞保存液,pH值调定为PH为7.2-7.4,渗透浓度渗透压为305±10mmol/L2.实验分组Ⅰ组：即对照组,常规培养C3A细胞不经低温保存；按保护液不同分3组,Ⅱ组：乳酸钠林格氏液（RL）；Ⅲ组：新型生物人工肝保存液（NBS）；Ⅳ组：UW液。3.肝细胞的低温保存及复苏：将培养传代后C3A细胞经0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,以3×105个细胞接种于6孔培养板中常规培养48 h,允许细胞贴壁生长。将细胞培养液弃去,用预先冷却至4℃的PBS漂洗细胞2次,分别加入2mL预先冷却至4℃的各组保护液,封口膜封口保持气密性,快速置于4℃冰箱中,保存24,48,72 h后,从4℃冰箱中取出快速置入37℃水浴锅中水浴复温5min,留取保存液上清待检。4.研究内容及检测方法：各组保存液分别保存C3A细胞24h、48、72h后,分别观察以下内容：肝细胞存活率、光镜形态学变化、肝细胞酶学（ALT、AST）、肝细胞中MDA含量、复苏后肝细胞合成Alb、肝细胞凋亡。通过以上指标的比较,初步判定新型保存液对生物人工肝用肝细胞的保存效果。5.统计处理：全部采取SPSS 13.0软件进行统计分析。组间采用析因方差分析,当存在交互效应时采用分开各因素进行One-Way ANOVA单因素方差分析组间效应,单向方差分析采用LSD法,当总体方差不齐时采用Dunnett’s T3法;P<0.05为有统计学差异。研究结果：1低温保存不同时间肝细胞形态学改变：随着保存时间的延长,各组保存液两组均不同程度出现肝细胞肿胀、空泡样等肝细胞肿胀变圆。RL组肝细胞在保存24 h后即见细胞开始脱落坏死。NBS组及UW液组出现细胞间隙增宽,但细胞却以皱缩为主。在光镜观察下NBS组与UW液组未见明显区别。2.低温保存后细胞存活率检测：NBS组与UW液组肝细胞存活率低温24h、48h无明显差异,而保存72h后NBS组保存液存活率低于UW液组。对照组RL组在保存24h后即见开始出现大片细胞坏死脱落,存活率明显下降。3.肝细胞酶学变化：NBS组和UW液组肝细胞低温保存后ALT、AST均见升高,在低温保存复苏24h后呈现出一个急剧升高的波峰,在经换液处理后峰值明显下降,随着复苏后的继续培养,各个保存时间中UW液组肝细胞的活力及细胞状态均较优于NBS组,细胞较早进入指数生长期并出现较早出现重叠生长。肝细胞酶学也出现相应的升高,但幅度较之低温保存后酶学升高明显为小。4.复苏后肝细胞合成Alb:NBS组与UW液组在低温保存24h、48h后复苏再培养中白蛋白合成功能无显著性差异,而随着保存时间延长到72h后,UW液组肝细胞白蛋白合成功能明显优于NBS组。5.肝细胞凋亡：吖啶橙/碘化丙啶双染结果可见,RL组在保存24 h后即见较多细胞凋亡,胞核固缩状、呈增强的、明亮的绿色荧光,并随着时间的延长,胞核呈固缩状、团块状结构,甚至呈现出“黄”色。保存48h,72 h可见坏死或晚期凋亡,核为较大的圆形结构着橘红色,或橘红色并呈固缩状或圆珠状。而UW液组及NBS组在保存24 h及48 h中同样观察到细胞凋亡现象,在同时间点NBS组与UW液比较无明显差异研究结论：作为生物人工肝用肝细胞低温保存液的效果方面,在低温保存48h内NBS液与UW液在提高肝细胞存活率、减轻肝细胞损伤、保护肝细胞功能和防止肝细胞凋亡等方面作用相近。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 新型生物人工肝用肝细胞保存液的配制
• 一、新型生物人工肝用肝细胞保存液的组成
• 二、新型生物人工肝用肝细胞保存液的基本特性
• 三、UW、HTK、NBS保存液配方成分设计的比较
• 四、配制前准备及配制程序
• 五、新型生物人工肝用肝细胞保存液配方的特点
• 讨论
• 第二部分 新型生物人工肝用肝细胞保存液的细胞实验
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明