论文摘要
研究背景:整合素ανβ6作为一种只在发生恶性病变的上皮组织中表达的粘附因子,目前在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及口咽部癌中的研究已经取得了重要的成果,尤其是在结肠癌方面的研究,更加深入细致;并且证实,ανβ6在上述恶性肿瘤中对肿瘤的发生、发展、浸润及转移方面起到重要的促进作用。但是在胃癌中关于整合素ανβ6的研究,目前尚未见报道。胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,预后很差;目前在我国,其发病率及死亡率居全部恶性肿瘤之首;在世界上居癌症死亡原因的第二位;而结肠癌的发病率和死亡率亦居高不下。因此,寻找一种有效地治疗胃癌和结肠癌的手段,已成为医学工作者迫在眉睫的任务。既然整合素ανβ6在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及口咽部癌中具有重要的促进肿瘤生长的作用,那么是否在胃癌中也具有类似的作用?是否可以成为治疗胃癌和结肠癌的一种有效的针对目标呢?我们的课题就是基于这样的背景和目的而展开的研究。第一部分整合素ανβ6对胃癌细胞增殖浸润的作用目的研究整合素ανβ6在胃癌细胞的生存、增殖、浸润及转移中所起的作用。方法先应用流式细胞术筛选表达整合素ανβ6的胃癌细胞AGS进行培养;构建针对ανβ6的小片段干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,采用脂质体2000转染入细胞,然后应用RT-PCR及Western Blotting检测转染后,细胞内整合素ανβ6的表达被抑制的效果。对照组细胞采用只加脂质体2000的细胞和阴性siRNA（negative-siRNA）转染的细胞。转染前后,采用MTT方法检测细胞增殖能力的变化;粘附分析检测细胞对细胞外基质的粘附能力变化;酶谱法检测细胞分泌MMP-9的变化;Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化;裸鼠皮下种植细胞,观察其成瘤能力的变化。通过比较试验组和对照组之间的各试验数据的差别,分析整合素ανβ6所起的作用。结果转染后48小时,应用RT-PCR及Western Blotting检测发现,AGS细胞内整合素ανβ6的表达在mRNA水平及蛋白水平均被明显抑制;抑制了整合素ανβ6的表达后,MTT检测发现细胞的增殖力仅为对照组细胞的49.3%（P＜0.01）;粘附分析发现细胞的粘附力仅为对照组细胞的79%（P＜0.01）;酶谱分析见细胞分泌MMP-9的能力为对照组细胞的18.3%（P＜0.01）;侵袭试验见细胞的侵袭力为对照组细胞的28%（P＜0.01）;成瘤试验见试验组细胞形成肉眼可见的肿瘤的时间约为种植后13天,而对照组细胞为6天;种植后6周,试验组细胞形成肿瘤的平均体积约为820mm3,而对照组细胞约为160 mm3（P＜0.01）。结论整合素ανβ6对胃癌细胞AGS的增殖、粘附、侵袭能力起着重要的促进作用,抑制了ανβ6的表达,就可以抑制AGS细胞的增殖和侵袭。意义揭示了整合素ανβ6在胃癌细胞增殖侵袭及转移中的重要作用,丰富了整合素ανβ6的理论知识,并为靶向治疗胃癌的研究提供了确切的理论依据。第二部分整合素ανβ6在胃及结肠癌细胞凋亡中的作用目的研究整合素ανβ6对胃癌及结肠癌细胞凋亡的影响。方法应用针对整合素ανβ6的siRNA抑制胃癌AGS细胞中ανβ6的表达,而用针对ανβ6的单克隆抗体10D5封闭结肠癌细胞HT29中ανβ6的功能后,用Hoechst荧光染色检测细胞凋亡形态学及凋亡率的变化;应用caspase-3活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3活性的变化;应用Western Blotting检测细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Fas,Fas-ligand等的变化,以及细胞内细胞色素C的分布和磷酸化ERK,JNK,p38（P-ERK,P-JNK,P-p38）等的变化。结果抑制了整合素ανβ6的表达（AGS）,或者封闭了ανβ6的功能后（HT29）,细胞出现明显凋亡的形态学变化,细胞体积缩小,染色质浓缩、碎裂、荧光染色明显增强,并出现典型的凋亡小体。细胞凋亡率明显增高,与对照组细胞相比较,P＜0.01。caspase-3活性检测证实,两种细胞内caspase-3的活性均明显增强;Western Blotting结果显示,抑制了ανβ6的表达后,AGS细胞内Fas,Fas-ligand的表达增高;Bax表达增高,而Bcl-2的表达降低;细胞色素C由线粒体释放入细胞质中;细胞内P-ERK表达降低,P-p38表达增高;分别与对照组相比较,P＜0.01;而P-JNK无明显变化（P＞0.05）。而在HT29细胞中,应用10D5封闭了ανβ6的功能后,HT29细胞中Bcl-2的表达降低,Bax表达增高（P＜0.01）,而Fas和FasL的表达均无明显变化（P＞0.05）。细胞色素C由线粒体释放入细胞质中;细胞内P-ERK表达降低（P＜0.01）,而P-p38和P-JNK均无明显变化（P＞0.05）。结论整合素ανβ6在胃癌细胞AGS和结肠癌细胞HT29中都起着重要的抑制凋亡的作用,抑制了ανβ6的表达或者封闭了ανβ6的功能,细胞的凋亡率都会明显增高;在AGS细胞凋亡的过程中,死亡受体途径和线粒体途径均参与其中,而在HT29细胞的凋亡过程中,仅有线粒体途径参与;另外,MAPK途径在此凋亡过程中,发挥了重要作用;P-ERK在AGS和HT29细胞中均具有抑制凋亡的作用,而P-p38仅在AGS细胞中发挥了促进凋亡的进程。意义揭示了整合素ανβ6在抑制胃癌及结肠癌细胞凋亡中的重要作用及其详细的调控机制,丰富了整合素ανβ6的理论知识,并为靶向治疗胃癌及结肠癌的研究提供了确切的理论依据。第三部分整合素ανβ6在胃癌预后中的作用目的研究整合素ανβ6在胃癌组织中的表达情况,以及ανβ6对胃癌预后的影响。方法选择300例胃癌病人的手术病理标本,制作组织芯片,并行整合素ανβ6的免疫组化染色;回顾性分析这些病人的临床病例资料,结合免疫组化结果,分析整合素ανβ6在胃癌组织中的表达与其临床病理资料之间的关系;并通过生存分析,判断其对胃癌病人预后的影响。结果整合素ανβ6在胃癌组织中的整体表达率约为36.7%;其表达与病人的年龄、性别以及肿瘤的大小无明显关系,而与肿瘤的Lauren分型、分化程度、有无淋巴结转移、有无远处转移、以及TNM分期相关。整合素ανβ6表达阳性的病人,其生存时间较ανβ6表达阴性的病人明显缩短;且此关系在早期或晚期肿瘤病人中均存在,特别是在早期胃癌病人中更加明显。结论整合素ανβ6对胃癌病人的生存是一种重要的危险因素。意义揭示了整合素ανβ6在胃癌组织中的表达情况及其与各临床病理特点之间的关系,并首次证实了整合素ανβ6在胃癌预后中的重要作用,丰富了整合素ανβ6的理论知识,并为靶向治疗胃癌的研究提供了确切的理论依据。
论文目录
相关论文文献
标签：整合素论文; 胃癌论文; 干扰论文; 增殖论文; 侵袭论文; 皮下种植论文; 结肠癌论文; 凋亡论文; 预后论文;