运用PCR-DGGE和Real-time PCR方法分析奶牛瘤胃微生物区系差异

论文摘要

本研究包括2个试验,用于研究奶牛瘤胃固相与液相微生物区系以及不同饲料固相粘附微生物的区别。主要研究工作如下：运用PCR-DGGE分析比较奶牛瘤胃中三种不同饲料固相粘附微生物区系分析奶牛瘤胃中苜蓿、青贮玉米和羊草三种饲料固相粘附微生物菌群结构,获得附着于不同粗饲料微生物区系的差异。选择3头健康且体重相似的装有永久瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,将苜蓿、青贮玉米和羊草分别装入尼龙袋,在瘤胃中孵育24 h后取出,PBS洗脱获得固相粘附微生物,提取总DNA后,采用变性梯度凝胶电泳技术（Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）分析群落结构,选取清晰条带测序后构建系统发育树。不同样品的DGGE图谱条带的数目和和条带颜色深浅有一定差异；苜蓿与青贮玉米和羊草间相比相似性较低,青贮玉米与羊草间的相似性较高；三种饲料及瘤胃内容物固相粘附微生物的Simpson多样性指数差异显著（P<0.05）, Shannon-Wiener多样性指数差异不显著（P>0.05）；三种饲料固相粘附微生物条带近源种分别归属Butyrivibrio、Fibrobacter、Prevotella、Succiniclasticum、Pseudobutyrivibrio5个属。三种饲料固相粘附微生物的种群构成存在差异。运用DGGE和Real-time PCR比较荷斯坦奶牛瘤胃固、液相附着微生物区系应用变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）和定量PCR方法（Real-time PCR）对荷斯坦奶牛瘤胃内容物液、固相附着微生物区系进行比较和定量研究。采集4头荷斯坦奶牛瘤胃内容物,固液分离后对各相中所附着的微生物用DGGE和定量PCR方法进行比较分析,其中定量分析包括总细菌和琥珀酸丝状杆菌。固相液相微生物的DGGE图谱显示,三者的条带数目和颜色有一定差异：聚类分析表明固相（松散粘附）微生物与固相（紧密粘附）微生物相似性大于液相与这二者的相似性；固液相微生物区系的均一性指数差异显著（P<0.05）,液相最高,而香农指数和优势度指数差异不显著（P>0.05）；固相（紧密粘附）中总细菌的基因拷贝数与液相和固相（松散粘附）中总细菌的基因拷贝数差异极显著（P<0.01）,固相（紧密粘附）最高,而液相和和固相（松散粘附）中总细菌的基因拷贝数差异不显著（P>0.05）；固相（紧密粘附）与液相和固相（松散粘附）相比,纤维降解菌的基因拷贝数最高。瘤胃固、液相中的微生物区系存在筹异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 瘤胃内纤维素降解过程及主要相关微生物
• 1.1.1 瘤胃内纤维素降解过程
• 1.1.2 瘤胃纤维降解菌及相应的纤维素酶
• 1.1.3 纤维素酶
• 1.2 日粮改变条件下瘤胃微生物区系的动态变化
• 1.2.1 瘤胃微生物组成
• 1.2.2 精饲料与高粗饲料转变条件下瘤胃微生物的动态变化
• 1.2.3 向饲料中添加不同物质时瘤胃微生物的动态变化
• 1.3 瘤胃微生物分子生物学研究方法
• 1.3.1 瘤胃微生物定量技术
• 1.3.2 指纹图谱技术在瘤胃微生物多样中的应用
• 1.4 本论文的研究目的及意义
• 第2章 运用PCR-DGGE分析比较奶牛瘤胃中三种不同饲料固相粘附微生物区系
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 试验试剂及耗材
• 2.1.3 试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 饲料孵育与前处理
• 2.2.2 固相粘附微生物总DNA提取及纯化
• 2.2.3 16s rDNA V3区域PCR扩增
• 2.2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 2.3.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 2.3.3 系统发育分析
• 2.4 讨论
• 第3章 运用DGGE和Real-time PCR比较荷斯坦奶牛瘤胃固、液相附着微生物区系
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验动物
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 DGGE指纹图谱建立及分析
• 3.2.2 Real-time PCR
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介