论文摘要
目的:观察比较SD大鼠在骨折合并脑外伤以及在单纯骨折时,骨折愈合的过程中骨痂内血管内皮细胞生长因子VEGF的表达变化;探讨VEGF在大鼠骨折合并脑外伤后的骨折加速愈合中的作用机制,以期为临床选择性地应用VEGF基因疗法治疗难治性骨折提供理论依据。方法:SD大鼠66只分为3组:正常对照组（N）6只,骨折组（F）30只,骨折合并脑外伤组（TBI+F）30只。脑外伤模型采用改进的Marmarou自由落体装置撞击大鼠颅骨制作弥漫性中度脑损伤模型。骨折模型制造方法:于左侧下肢膝关节处纵向剪开皮肤,暴露并剥离膝关节韧带,在胫骨髁间处钻孔,沿髓腔方向插入直径约25mm的无菌克氏钢针。在胫骨中上1/3处钝性剥离肌肉筋膜,横向折断胫骨,逐层关闭切口。SD大鼠编号称重后,10%水合氯醛腹腔注射（3ml/kg）,麻醉生效后固定于特制手术台上,手术过程均在严格无菌条件下进行,术后放置于笼中自由活动、随意进食水。F组和TBI+F组动物,分别于术后第3d、7d、14d、24d、42d各处死6只进行X线摄片,以观察骨折修复过程和效果。并在距离骨折断端大约1cm处截取骨痂标本,取其中一半迅速去除软组织,用冷生理盐水冲净血液后置液氮中保存,用于RT-PCR检测。一半组织用于光镜观察和免疫组化染色。结果:1 X线观察1.1 F组:骨折后3、7、14d骨折线清晰,未见骨痂形成;24d骨折线较清晰,有骨痂形成,量较少;42d骨折线模糊,仍隐约可见,骨折周围有大量骨痂形成。1.2 TBI+F组:骨折后3、7d骨折线清晰,未见骨痂形成;14d骨折线较清晰,可见少量骨痂形成;24d骨折线变得模糊,骨折周围有较多骨痂形成;42d骨折线消失,伤肢已基本愈合,骨折周围可见大量骨性骨痂形成,局部增粗,骨密度较高。2逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测2.1 F组骨折后3d,未见到有明显VEGF的表达;在骨折后7d开始出现VEGF的表达且此后表达持续至24d时,至42d已经见不到VEGF的表达。2.2 TBI+F组骨折后3d即开始出现VEGF的表达,此后表达逐渐增强,持续到24d。至42d已经见不到VEGF的表达。3光镜观察3.1 F组骨折后3d,骨折端可见到少量肉芽组织形成;7d时可见到肉芽组织长入骨折端,并有软骨细胞形成;14d可见新生骨小梁形成;24d后,骨小梁开始相互连接;骨折后42d骨小梁逐渐开始塑形,向板层骨转化。3.2 TBI+F组骨折后3d,骨折端可见肉芽组织形成;骨折后7d,肉芽组织长入骨折端,并有软骨形成,个别可见到新生骨小梁形成;骨折后14d可见新生骨小梁形成;骨折后24d骨小梁开始相互连接、塑形;骨折后42d骨小梁开始向板层骨转化。4免疫组织化学染色4.1 F组骨折后3d,骨折端少量肉芽组织内偶尔可见到VEGF阳性染色细胞;骨折后7d骨折端骨细胞、成软骨细胞和肉芽组织内纤维母细胞、血管内皮细胞VEGF呈阳性染色,新形成的软骨基质VEGF呈阳性染色;骨折后14dVEGF在成骨细胞、软骨细胞和成纤维细胞均呈强阳性染色;骨折后24d,在软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞中VEGF呈阳性表达;骨折后42d,VEGF仅在部分软骨细胞上发现有阳性染色。4.2 TBI+F组骨折后3d骨折端肉芽组织内可见部分细胞呈VEGF阳性;骨折后7d骨折端骨细胞、成软骨细胞和纤维母细胞和新形成的软骨基质VEGF呈阳性染色,肉芽组织中纤维母细胞、血管内皮细胞VEGF亦呈阳性染色;骨折后14dVEGF在成骨细胞、成软骨细胞、肥大的软骨细胞和成纤维细胞均呈强阳性染色;骨折后24d在成熟软骨细胞、肥大软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞中VEGF呈阳性表达;骨折后42dVEGF仅在部分软骨细胞上发现有阳性染色。5图像分析表明:F组VEGF表达从7d开始出现,持续到3周左右达高峰;TBI+F组VEGF表达3d开始出现,2周达高峰,并持续到3周左右。在3、7d时,TBI+F组VEGF表达较F组显著增高,P﹤0.01,有统计学意义;在14d时,TBI+F组VEGF表达较F组增高,P﹤0.01,有统计学意义;至24d时,TBI+F组和F组VEGF表达无明显区别,P﹥0.05,无统计学意义;至42d时,两组均无表达。结论:1骨折愈合过程需要多因子参与、协调,VEGF有可能是作为骨折愈合过程中的一种重要因子在发挥作用。2单纯骨折后3周左右为VEGF表达的高峰期;中枢神经损伤合并骨折后2-3周为VEGF表达的高峰期,其表达高峰提前且持续时间较长。3中枢神经损伤后大鼠骨折愈合加速,骨痂量增多,表明中枢神经损伤对骨折愈合有促进作用。这可能与中枢神经损伤后大鼠体内生长因子特别是VEGF表达高峰提前且持续时间较长有关。4为VEGF安全有效地应用于临床治疗难治性骨折提供了新的途径和理论依据。