两种泥鳅中CYP19基因的克隆及表达分析

论文摘要

芳香化酶（aromatase）基因的全称是细胞色素P450芳香化酶基因（cytochrome P450 aromatase）,可缩写为P450arom或CYP19,芳香化酶是由CYP19基因编码,该酶是催化雄性激素合成雌性激素的限速酶及关键酶,对维持类固醇激素间的生理平衡具有重要作用,并对研究鱼类性别决定及分化机制有重要的参考意义。本文采用RT-PCR与RACE的方法,分别获得了4个CYP19基因片段。经测序和同源性分析发现,其中2个CYP19基因序列与斑马鱼CYP19a序列相似度达83%,另外两个与稀有鮈鲫的CYP19b序列相似度达84%,因此可认为所克隆的片段分别是CYP19a和CYP19b两种基因。根据命名法则命名为:MaCYP19a、PdCYP19a和MaCYP19b、PdCYP19b。用DNAMAN软件进行序列结果分析:MaCYP19a cDNA克隆片段大小为1815bp,含有503bp3’UTR,编码432个氨基酸残基;PdCYP19a cDNA克隆片段大小为1802bp,含有506bp3’UTR,编码430个氨基酸残基;MaCYP19b cDNA保守片段大小为428bp,编码142个氨基酸残基;PdCYP19b cDNA克隆片段大小为429bp,编码142个氨基酸残基。用MEGA4.0软件对15个物种的CYP19基因进行聚类分析,这两种泥鳅的CYP19基因分属于两个分支,即脑芳香化酶基因和性腺芳香化酶基因,CYP19基因与斑马鱼、鲤鱼的同源性最高,说明芳香化酶基因在进化上相对保守。以GAPDH为参照,用半定量RT-PCR和荧光实时定量RT-PCR两种方法研究两种泥鳅中CYP19在成体不同组织和胚胎不同发育时期的特异性表达,得出CYP19基因在脑和性腺的表达活性最高,在胚胎不同时期CYP19a和CYP19b基因表达差异较大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 性别决定机制的研究历史
• 1.2 生物界性别决定机制的多样性、复杂性
• 1.2.1 遗传型性别决定
• 1.2.2 环境依赖型性别决定
• 1.3 鱼类的性别决定及其性别分化机制
• 1.3.1 鱼类中性别决定的类型
• 1.3.2 性别决定及分化的分子机理
• 1.3.3 鱼类性腺的周年发育过程
• 1.4 芳香化酶与鱼类性别决定及分化的关系
• 1.4.1 芳香化酶基因（CYP19 基因）的特点
• 1.4.2 芳香化酶的生化性质及分布
• 1.4.3 芳香化酶对性别分化的影响及其活性调节
• 1.4.4 芳香化酶的分子克隆
• 1.5 3′RACE 和5′RACE 技术简介
• 1.5.1 3′RACE 的技术原理
• 1.5.2 5′RACE 的技术原理
• 1.6 本课题的研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 载体和宿主菌
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 本课题常用试剂配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 的制备
• 2.2.2 两种CYP19 cDNA 序列的克隆、测序与分析
• 2.2.3 CYP19 基因的表达模式
• 3 结果
• 3.1 两种CYP19 基因cDNA 序列的克隆
• 3.1.1 总RNA 的提取
• 3.1.2 两种泥鳅中两种CYP19 基因保守区域的克隆
• 3.1.3 两种泥鳅中3’RACE CYP19 扩增结果
• 3.2 两种泥鳅中CYP19 基因的序列分析
• 3.2.1 两种泥鳅中CYP19a 序列分析
• 3.2.2 两种泥鳅中CYP19b 序列分析
• 3.3 两种泥鳅中CYP19 基因与其他物种的同源性分析
• 3.3.1 两种泥鳅中CYP19a 序列同源性分析
• 3.3.2 两种泥鳅中CYP19b 序列同源性分析
• 3.3.3 两种泥鳅中CYP19 基因系统进化分析
• 3.4 两种CYP19 基因表达模式的分析
• 3.4.1 CYP19 基因六种成体组织中表达模式分析
• 3.4.2 两种CYP19 基因在胚胎发育五个时期中表达模式分析
• 4 讨论
• 4.1 序列分析
• 4.1.1 两种泥鳅中CYP19 基因的存在形式
• 4.1.2 芳香化酶保守区分析
• 4.2 两种泥鳅中 CYP19 基因的表达模式分析及功能预测
• 4.2.1 两种泥鳅中 CYP19 基因在成体不同组织中的特异性表达
• 4.2.2 两种泥鳅中CYP19 基因在胚胎不同发育时期的特异性表达
• 4.3 RACE 技术的注意事项
• 4.4 结语与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录