黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞NO浓度和PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

论文摘要

目的：探讨黄芪多糖（Astragalus Polysaccharides, APS）对2型糖尿病患者（T2DM）外周血内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells, EPCs）一氧化氮（nitric oxide, NO）浓度和蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/AKT）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）表达的影响,探讨APS对T2DM患者外周血EPCs的影响及其作用机制。方法：制备鼠尾胶原,选择T2DM患者和健康人对照组各20例,密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原预包被的培养瓶中培养,7d后收集贴壁细胞,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜鉴定EPCs。健康人EPCs仅作为对照组,不予药物干预；MTT实验检测APS对T2DM患者EPCs增殖的影响。观察不同浓度黄芪多糖（0,50,200,800,3200,6400mg/L）分别干预6、12、24、48h对T2DM患者EPCs的影响；然后加用PI3K抑制剂LY294002进行干预。用Griess重氮化反应法检测NO的浓度,Western blot检测磷酸化Akt （p-Akt-Ser473）及磷酸化eNOS（p-eNOS-Ser1177）的表达。结果：T2DM患者EPCs的增殖能力较健康对照组明显下降（P<0.05）。黄芪多糖（APS）显著增加T2DM患者EPCs的No浓度和增殖能力,呈一定的量效与时效关系,在200mg/l浓度时开始较T2DM对照组明显增强（P<0.01）,于800mg/l浓度时达最大效应（P<0.01）。800mg/1APS作用6h后,T2DM患者EPCs增殖能力开始明显增强,24h达到高峰,48h时略有下降,但仍明显高于对照组。APS呈剂量依赖性地增强T2DM患者EPCs磷酸化Akt及磷酸化eNOS的表达（P<0.05）；PI3K抑制剂LY294002能阻断黄芪多糖增强的磷酸化Akt和磷酸化eNOS的表达（P<0.05）。结论：鼠尾胶原可代替EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。黄芪多糖（APS）能通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路而升高EPCs NO的浓度,促进EPCs增殖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 材料和试剂
• 1.3 细胞培养所用液体的配制
• 2 方法
• 2.1 鼠尾胶原的制备
• 2.2 标本采集
• 2.3 内皮祖细胞的分离
• 2.4 内皮祖细胞的培养
• 2.5 内皮祖细胞的鉴定
• 2.5.1 内皮祖细胞的表面抗原检测
• 2.5.2 内皮祖细胞的染色鉴定
• 2.6 MTT法检测黄芪多糖对内皮祖细胞增殖的影响
• 2DM组EPC_s NO浓度的影响'>2.7 黄芪多糖对T₂DM组EPC_sNO浓度的影响
• 2.7.1 分组
• 2.7.2 细胞上清液NO水平测定
• 2DM组EPC_s p-AKT、p-eNOS蛋白表达影响'>2.8 黄芪多糖对T₂DM组EPC_sp-AKT、p-eNOS蛋白表达影响
• 2.8.1 分组
• 2.8.2 Western blot主要试剂配制
• 2.8.3 细胞总蛋白的提取
• 2.8.4 检测总蛋白浓度
• 2.8.5 蛋白质SDS-PAGE电泳
• 2.8.6 转膜
• 2.8.7 抗体孵育
• 2.8.8 化学发光,显影,定影
• 2.8.9 图像分析
• 3 统计学处理
• 4 结果
• 4.1 临床资料
• 4.2 内皮祖细胞的形态观察
• 4.3 内皮祖细胞的鉴定
• 4.4 黄芪多糖对内皮祖细胞增殖的影响
• 4.5 黄芪多糖和PI3K阻断剂LY294002对内皮祖细胞分泌NO的影响
• 4.6 黄芪多糖对内皮祖细胞p-AKT和p-eNOS蛋白表达的影响
• 5 讨论
• 6 结论
• 7 问题与展望
• 8 参考文献
• 附录一 缩略语表
• 附录二 综述
• 附录三 致谢
• 附录四 个人简介