虎杖苷对高原肺水肿模型大鼠的防治作用及其机制研究

论文摘要

1研究背景高原肺水肿（high altitude pulmonary edema, HAPE）是由于人体进入高原速度过快或在高原地区剧烈运动导致耗氧量增加而引起的一种严重威胁生命的急性重症高原病,如抢救不及时常威胁生命。一般认为高原低氧是HAPE的诱发因素之一,缺氧导致肺动脉压升高及血管内皮细胞损伤,肺毛细血管壁和肺泡上皮细胞通透性增加是HAPE的基本病理特征。HAPE的发病率在0.5%9.9%之间,通常在海拔3000米以上地区发生,并随着海拔的增高,发病率呈上升趋势。我国海拔3000米以上的高原占国土面积的1/4以上,因此HAPE发生机制及其防治一直是我国高原医学研究的热点问题。近年来,随着HAPE的深入研究,其临床治愈率明显提高。但现有的各种发病机制尚不能完全解释HAPE的病理生理改变,特别是现有药物对HAPE所致肺动脉高压的选择性较差,降低肺血管阻力特点不明显,作用靶点单一,副作用较大,因而限制其临床疗效和应用。随着天然药物研究的不断推进,越来越多的生药及其活性组分逐渐被人们发现和认可,在西医常规治疗HAPE的基础上,充分发挥天然药物的优势,积极发现并筛选出安全有效的活性成分,阐明其作用机制,可为我们治疗HAPE提供新的思路。虎杖苷（Polydatin,PD）是从植物虎杖中提取得到的一种天然单体活性成分,具有改善微循环,抑制血小板聚集,降低血浆粘度,抗脂质过氧化和抗病原微生物等作用。虎杖的提取液可明显降低缺氧引起的肺动脉高压,而且对肺血管具有一定的选择性。本实验室前期研究发现PD可通过增加大鼠血清、肺组织中NO含量和增强NOS活性等途径降低肺动脉高压、抑制肺血管重建。本课题通过模拟高原环境,采用低压低氧加复合运动的方法建立HAPE模型大鼠,观察PD对HAPE模型大鼠血流动力学、血液流变学、血管活性因子以及对缺氧培养的肺微血管内皮细胞（ Pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）的影响,从整体、细胞水平探讨其作用机制,为阐明PD降低肺动脉高压,防治HAPE提供实验依据,以期为临床治疗HAPE提供新方法。2研究目的研究PD对高原肺水肿模型大鼠的治疗作用及其机制。3研究方法3.1 PD对HAPE模型大鼠血流动力学和血气的影响3.1.1将健康SD大鼠随机均分为6组,即正常对照组、HAPE模型组(ig.0.5%羧甲基纤维素钠5mL·Kg-1)、PD低、中、高剂量组(ig. 20、40、80mg·Kg-1PD)、阳性药物对照组(ig.50mg·Kg-1PF)。3.1.2通过右心漂浮导管法测定大鼠肺血流动力学参数（PASP、PADP、mPAP）,同时记录心率（HR）。取左颈总动脉血,测定血气（PaO2、PaCO2和SaO2、）。计算肺体系数及RV/（LV + S）重量比值,求出右心室肥厚指数（RVHI）。3. 2 PD对HAPE模型大鼠血液流变学及血管活性因子影响3.2.1动物分组、给药及建立HAPE模型方法均与上述3.1.1方法相同。3.2.2将大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后,颈动脉插管取血4ml,分别进行全血粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数、血小板聚集功能、血小板粘附功能测定。3.2.3取大鼠动脉血3ml,按酶联免疫吸附法测定内皮素-1(ET-1)含量;用放免法测定血栓素A （TXA2）和前列环素（PGI2）的代谢产物血栓素B（TXB2）和6-酮-前列腺素（6-keto-PGFla）的含量。3.2.4取右肺组织匀浆,离心取上清液,按酶联免疫吸附法测定ET-1含量。另取左肺组织匀浆,离心取上清液,采用ELISA法测定VEGF含量。3.3 PD对缺氧所致大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）损伤的影响3.3.1取健康SD大鼠肺组织进行体外培养肺微血管内皮细胞（PMVECs）,选取生长良好的PMVECs（1×105个细胞/ml）种于96孔培养板中,每孔加入200μl低糖DMEM（含有5%胎牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml）同步化培养24h。然后分成八组:常氧空白组（21%O2,5%CO2,74%N2）,常氧+PD低、中、高剂量组(30μmol·L-1、60μmol·L-1、120μmol·L-1),低氧空白组（1%O2,5%CO2,94%N2）,低氧+PD低、中、高剂量组(30μmol·L-1、60μmol·L-1、120μmol·L-1)。空白组仅加入200μl低糖DMEM培养液,给药组加入200μl按上述浓度配好的含药低糖DMEM培养液。3.3.2常氧条件下用MTT法检测PD对PMVECs的细胞。3.3.3根据实验分组加入相应的培养液,在三气培养箱中设置常氧、低氧条件后,MTT法检测各组细胞吸光度值。3.3.4采用LDH测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测各组细胞培养上清液中LDH活性。3.3.5根据实验分组加入相应的培养液,通过SABC法免疫组化染色,检测各组中VEGF的表达。3.3.6根据实验分组加入相应的培养液,取细胞培养上清液,采用ELISA法检测细胞上清液中VEGF的含量。4实验结果4.1 PD对HAPE模型大鼠肺血流动力学和血气的影响模型组PASP、PADP、mPAP均显著高于正常对照组（P<0.01）;PD低剂量组PASP、PADP、mPAP均高于正常对照组（P<0.01）;PD中、高剂量组及阳性对照组与模型组相比,能显著降低肺动脉高压（P<0.05或P<0.01）,且PD中、高剂量组作用效果与阳性药物对照组相当。血气分析显示:与正常对照组比较,模型组PaO2和SaO2均显著降低（P<0.05）,PaCO2无明显变化;与模型组相比,PD中、高剂量组及阳性药物组,能使PaO2和SaO2显著升高（P <0.05）。模型组大鼠的肺质量、肺体系数分别比正常对照组平均增加33.91%、65.83%,说明肺水肿程度明显（P<0.05）;与模型组比较,虎杖苷中、高剂量治疗组和阳性药物组肺质量和肺体系数均明显减轻（P<0.05或P<0.01）,虎杖苷各给药组与阳性药物对照组无明显差异（P>0.05）。与正常对照组比较,模型组右心室肥厚指标均明显升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较,虎杖苷中、高剂量组能有效地抑制低压低氧引起的大鼠心脏指数的升高,从而对抗大鼠右室肥厚的形成（P<0.05）。4.2 PD对HAPE模型大鼠血液流变学和血管因子的影响模型组与正常组对照组比较,血浆粘度及全血高切变率粘度、低切变率粘度指标均增高,均具有显著差异（P<0.05或P<0.01）;PD各剂量组及阿魏酸哌嗪组,与模型组比较在降低血浆粘度及高、低切变率下的全血粘度上具有显著性差异（P <0.05）;但PD低剂量组对全血粘度影响较小,仅显示下降趋势。与模型组大鼠比较,PD各剂量组及阳性药物组均可显著降低红细胞压积和聚集指数并降低纤维蛋白原含量（P<0.01）;PD各剂量组与模型组比较,显著降低血小板聚集率和血小板粘附率（P<0.05或P<0.01）。PD中、高剂量组和阳性药物组均可明显降低血浆ET-1、TXB2水平,增加血浆PGF1α及PGF1α/TXB2比值（P<0.05或P<0.01）。PD中、高剂量组和阳性药物组大鼠肺组织ET-1含量明显减少（P<0.05）,但与正常对照组相比,均未达到正常值水平（P >0.05）;PD高剂量组和阳性药物组使大鼠肺组织VEGF含量下降明显（P<0.05）。4.3 PD对缺氧培养的大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的影响在常氧条件下,经MTT法检测,PD各剂量组(30、60、120μmol·L-1),与正常对照组相比,细胞存活率无明显变化（P >0.05）。与常氧空白组比较,低氧空白组PMVECs数量显著减少（P<0.05）;与低氧空白组比较,PD各剂量组PMVECs活性显著提高（P<0.05或P<0.01）,且随PD浓度增加,对低氧所致PMVECs抑制作用对抗增强,并呈现一定的量效关系。与常氧空白组比较,低氧组细胞上清中LDH活力明显升高,具有显著性差异（P<0.05）,PD各剂量组均能显著减少缺氧引起LDH释放（P<0.05）,且表现出明显的剂量依赖关系。VEGF免疫组化染色后检视,可见常氧组染色不明显;而低氧空白组染色较深,PD给药中、高剂量组染色变浅,说明PD对低氧所致PMVECs的VEGF表达增加有一定的抑制作用。ELISA法检测PMVECs在常氧和低氧条件下PD干预后VEGF含量的变化,以吸光度为横坐标,浓度为纵坐标,建立VEGF标准工作曲线,C=-102.1045A+779.4202,r=0.9997,VEGF含量在0～1000pg/ml范围内线性关系良好。低氧环境下VEGF显著增高（P<0.01）;低氧环境下给药组VEGF含量显著下降（P<0.05）;而常氧给药组与空白组相比较无显著性差异（P>0.05）。5结论5.1 PD能够降低HAPE模型大鼠肺动脉高压,改善肺血管收缩状态。PD在短时间内使PaO2和SaO2显著升高,改善氧合,产生对急性低氧的适应,降低肺血管阻力,从而降低肺动脉压,降低肺水肿程度。5.2 PD具有的改善血液循环的作用可能使HAPE模型大鼠的高粘度血液、变形力下降的红细胞流经血管床时,血流速度加快、血管阻力下降,从而改善了肺血管的微循环,使模型大鼠肺动脉压下降。5.3 PD具有对抗低氧诱导PMVECs氧化损伤的作用。PD还能直接抑制低氧所致的VEGF表达增加,说明PD在低氧环境下对PMVECs有良好的保护作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 高原肺水肿的研究进展
• 2 高原肺水肿的治疗
• 3 虎杖苷与高原肺水肿
• 实验一 虎杖苷对高原肺水肿模型大鼠血流动力学和血气的影响
• 0 引言
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 实验二 虎杖苷对高原肺水肿模型大鼠血液流变及血管活性物质的影响
• 0 引言
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 实验三 虎杖苷对低氧所致大鼠肺微血管内皮细胞损伤的保护作用
• 0 引言
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢