急性髓系白血病M2CD33+/CD34+细胞表面核酸适体的筛选与克隆及序列分析

论文摘要

背景与目的：白血病是一种起源于骨髓造血干细胞的恶性疾病,对白血病的准确诊断,有助于白血病的正确治疗并提高其治愈率,但目前仍然缺乏针对白血病细胞特异的诊断方法。指数富集配基的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技术是将化学和分子生物学相结合形成的一种新技术,应用此技术可以筛选出特异性结合靶细胞的适体（aptamer）,并将其用于肿瘤的诊断。为此,本研究应用细胞-SELEX技术,从随机寡核苷酸文库中筛选与急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia AML）M2细胞高亲和力高特异性结合的aptamers,为白血病的分子诊断奠定基础。方法：应用免疫磁珠分选法,首先从AML-M2患者骨髓细胞中两次正性分选出CD33+／CD34+细胞,并用流式细胞术检测其纯度。然后,以AML-M2 CD33+／CD34+细胞为靶细胞,正常人CD33+／CD34+细胞为反筛选细胞,采用细胞-SELEX （cell-SELEX,c-SELEX）技术从体外单链DNA（single-stranded deoxyribonucleic acid,ssDNA）文库中筛选出与AML-M2细胞特异结合的aptamers,并采用流式细胞术检测aptamers与AML-M2细胞的富集度。最后,将最终轮次筛选的产物进行扩增、克隆和测序,并分析其结构。结果：经过13轮次的筛选,ssDNA文库与AML-M2细胞的富集度从0.7%增加到52.9%,且第12轮时趋于平衡。对所获得的30个aptamers序列分析显示,大多数aptamers含有CCCCT、CTCTC和CTCAC 3个保守序列中的一种,但其中2个aptamers不含有这这些保守序列。二级结构分析获得3种不同类型的模拟二级结构。结论：利用细胞-SELEX技术,本研究成功筛选出与AML-M2 CD33+/CD34+细胞结合的aptamers,为白血病的分子诊断奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词简表
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 研究对象
• 1.1.2 主要试剂及配方
• 1.1.3 主要仪器及设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 骨髓单个核细胞分离
• +/CD34⁺细胞分选'>1.2.2 CD33⁺/CD34⁺细胞分选
• 1.2.3 aptamer的筛选
• 1.2.4 aptamer的克隆和序列测定
• 1.2.5 aptamer结构分析
• 第二章 结果
• +/CD34⁺细胞纯度'>2.1 CD33⁺/CD34⁺细胞纯度
• 2.2 aptamer筛选结果
• 2.3 aptamer富集度
• 2.4 aptamer测序结果
• 2.5 aptamer一级结构与二级结构分析
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢