连香树干旱胁迫过程中的生理变化与基因差异表达分析

论文摘要

干旱是主要的环境胁迫因子之一,它严重影响着植物生长和产量。在干旱条件下,许多基因参与了植物对干旱胁迫的响应,然而,目前只有为数不多的基因的详尽功能得到了阐明,并且这方面的大部分工作是在一年生草本模式植物如拟南芥、烟草及水稻上完成的,对林木相关的研究较少。为了研究植物的抗旱机理,发掘抗旱基因,本研究以木本植物连香树为材料,通过抑制消减杂交（SSH）的方法,对连香树在干旱条件下的特异转录组进行研究,结合连香树在干旱条件下种子和二年生幼苗的生理生化变化,对连香树的抗旱机理进行了分析探讨;同时利用抑制消减文库中的差异表达基因片段,采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）方法,对8个差异表达基因片段的表达情况进行分析,验证SSH技术的可靠性。主要研究结果如下:①以连香树种子为试验材料,研究了不同浓度聚乙二醇6000（PEG 6000）对种子萌发的影响。结果表明:适宜浓度(140～301 g·L-1)的PEG预先引发处理连香树种子,能促进种子萌发和芽苗生长,增加渗透调节物质如可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的含量,提高保护性酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性,降低丙二醛（MDA）含量,修复膜系统损伤,提高其抗旱性。此外,种子干旱胁迫试验也表明,在干旱胁迫下,伴随PEG浓度的增加,连香树种子萌发和幼苗生长受到抑制,可溶性蛋白含量先升高后降低,可溶性糖、脯氨酸和MDA含量升高,保护性酶SOD和CAT的活性升高及POD活性下降。连香树对干旱胁迫较为敏感,PEG浓度≥95 g·L-1会对种子萌发、芽苗胚轴和胚根生长产生抑制作用。②通过采用PEG 6000在室内模拟干旱条件,对二年生连香树实生苗进行干旱胁迫,以研究胁迫对其生理特性的影响。结果表明:随着胁迫浓度的增加和时间的延长,叶片中总叶绿素含量明显降低;在轻度胁迫下(PEG浓度为50～150 g·L-1)可溶性蛋白含量上升,而重度胁迫下(200 g·L-1)可溶性蛋白含量先升高后降低。伴随PEG浓度的增加,可溶性糖、脯氨酸和MDA含量升高,保护性酶POD活性升高、CAT活性下降,SOD活性先增强后减弱。由此说明,连香树在干旱胁迫下通过增加渗透调节物质含量,降低水势,加强保水力来提高其抗旱能力:并通过增强抗氧化酶活性,提高抗氧化能力,来减轻干旱胁迫伤害。③以干旱胁迫处理的连香树芽苗SB4和未处理的芽苗SB0,进行抑制消减杂交,构建了共包含768个阳性克隆的正、反向cDNA文库。利用斑点杂交技术进行阳性克隆筛选,共获得差异克隆309个。对309个阳性克隆进行测序,共获得241条uniESTs序列。通过进行BlastX和BlastN分析,有199条ESTs序列与己知功能的基因序列相似,其余的109条与未知功能的基因序列相似。④对文库进行Gene Ontology（GO）分类,使我们从不同角度理解199个uniESTs序列在细胞组件、分子功能和生物学途径中的作用。根据这些ESTs所代表的基因的生理生化作用,按功能将其分为13类。其中有103个基因与干旱胁迫关系密切,并对它们进行了分析讨论。连香树的抗旱胁迫过程涉及信号转导与基因的表达调控、渗透胁迫物质的合成、防御反应、转运作用与离子平衡、活性氧清除、救援和防御蛋白合成、修复和保护光合系统等多种途径的综合作用。⑤文库提供了大量有关抗旱胁迫基因的相关信息,如海藻糖-6-磷酸合酶（trehalose-6-phosphate phosphatase）、S-腺苷蛋氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase）、G蛋白类（G protein）、钙调蛋白（calmodulin）、钙结合EF家族蛋白（calcium-binding EF hand family protein）、ADP糖基化因子（ADP ribosylation factor）、bZip转录因子（bZip transcription factor）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine phosphataseprotein）、脂质转运蛋白（lipid transfer protein）、H+-ATP酶（H+-transporting two-sector ATPase）、水通道蛋白（aquaporin）、ABC转运蛋白家族（ABC transporter protein）、过氧化氢酶（catalase）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase）、硫氧还蛋白（thioredoxin）、类金属硫蛋白（metallothionein-like protein）、谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase）、核酮糖1,5-二磷酸羧化加氧酶（Rubisco）、OEE蛋白（oxygen-evolving enhancer protein）、叶绿素a/b结合蛋白复合物（chlorophyll a/b binding protein）、类萌芽素蛋白（germin-like protein）、扩张蛋白（expansin）、胚胎发育后期丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein）、茉莉酮酸酯诱导蛋白（iasmonate-induced protein）、细胞色素P450（cytochrome P450）和硒结合蛋白（seleniumbinding protein）等,这些ESTs序列的获得,为克隆与分析抗性相关基因奠定了良好的基础。⑥选取8个差异表达基因片段,采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行荧光实时定量PCR分析,对SSH结果进验证,结果与抑制消减杂交实验基本一致,表明SSH结果能够正确真实反映被检测基因的表达变化规律,其结果准确可靠。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1 选题的背景及意义
• 2 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 文献综述
• 1 植物对干旱胁迫的适应机制
• 1.1 渗透调节机制
• 1.1.1 脯氨酸
• 1.1.2 甜菜碱
• 1.1.3 可溶性糖
• 1.1.4 多胺
• 1.2 抗氧化防御机制
• 1.2.1 保护酶系统
• 1.2.2 抗坏血酸-谷胱甘肽系统
• 1.3 脱落酸的调节机制
• 1.4 光合作用的改变与代谢调节
• 1.5 协同作用机制
• 2 植物抗旱相关基因研究进展
• 2.1 抗旱相关基因的功能分类
• 2.2 调控性抗旱相关基因
• 2.2.1 信号传导相关蛋白
• 2.2.2 调控转录相关蛋白
• 2.2.3 转录因子相关蛋白
• 2.3 功能性抗旱相关基因
• 2.3.1 水分运输相关基因
• 2.3.2 抗脱水相关基因
• 2.3.3 渗透调节相关基因
• 2.3.4 调节气孔开关相关基因
• 2.3.5 转运体蛋白
• 2.3.6 防卫性相关基因
• 2.3.7 衰老相关基因
• 2.3.8 细胞壁合成相关基因
• 2.3.9 光合相关基因
• 2.4 展望
• 参考文献
• 第三章 干旱胁迫对连香树种子萌发和芽苗生理变化的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 PEG引发处理
• 2.2.2 PEG胁迫处理
• 2.2.3 种子萌发及芽苗形态指标
• 2.2.4 生理生化指标
• 2.3 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 PEG引发处理和干旱胁迫对种子萌发过程的影响
• 3.2 PEG引发处理和干旱胁迫对芽苗生理生化指标的影响
• 3.2.1 对可溶性蛋白含量的影响
• 3.2.2 对可溶性糖含量的影响
• 3.2.3 对脯氨酸含量的影响
• 3.2.4 对丙二醛（MDA）含量的影响
• 3.2.5 对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
• 3.2.6 对过氧化物酶（POD）活性的影响
• 3.2.7 对过氧化氢酶（CAT）活性的影响
• 4 结论与讨论
• 4.1 PEG预先引发处理对连香树种子萌发和芽苗生长的影响
• 4.2 PEG干旱胁迫处理对连香树种子萌发和芽苗生长的影响
• 参考文献
• 第四章 干旱胁迫对连香树幼树生理变化的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 处理
• 2.3 方法
• 2.4 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 干旱胁迫对叶绿素含量的影响
• 3.2 干旱胁迫对可溶性蛋白含量的影响
• 3.3 干旱胁迫对可溶性糖含量的影响
• 3.4 干旱胁迫对脯氨酸含量的影响
• 3.5 干旱胁迫对MDA含量的影响
• 3.6 干旱胁迫对SOD活性的影响
• 3.7 干旱胁迫对POD活性的影响
• 3.8 干旱胁迫对CAT活性的影响
• 4 结论与讨论
• 4.1 干旱胁迫与叶绿素含量变化的关系
• 4.2 干旱胁迫与渗透调节物质含量变化的关系
• 4.3 干旱胁迫与膜脂过氧化和抗氧化酶活性变化的关系
• 参考文献
• 第五章 连香树干旱胁迫抑制消减杂交cDNA文库的构建
• 1 前言
• 1.1 抑制性消减杂交技术产生的背景
• 1.2 抑制性消减杂交方法的原理
• 1.3 抑制性消减杂交技术的优缺点
• 1.4 抑制性消减杂交技术在植物研究中的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 抑制性消减杂交文库构建方法
• 2.2.2 差异筛选cDNA文库
• 2.2.3 阳性克隆测序与数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 高质量连香树总RNA的提取
• 3.2 反转录及酶切效果检测
• 3.3 接头连接效率分析
• 3.4 消减cDNA文库消减效率检测
• 3.5 消减cDNA文库的构建和PCR筛选
• 3.6 阳性克隆测序和同源性检索
• 4 结论与讨论
• 4.1 抑制消减杂交技术的应用
• 4.2 抑制消减杂交技术与斑点杂交技术结合研究基因表达谱的可行性
• 4.3 胁迫诱导表达基因分析
• 4.4 基因表达谱的完善
• 参考文献
• 第六章 连香树干旱胁迫差异表达基因功能分类
• 1 前言
• 1.1 Gene Ontology（GO）简介
• 1.2 Blast2GO（B2G）简介
• 2 分析策略及方法
• 3 结果与分析
• 3.1 Blsat结果与分析
• 3.2 Mapping结果与分析
• 3.3 Annotation绝果与分析
• 3.4 GO功能注释
• 3.5 SSH文库的ESTs功能分类
• 4 结论与讨论
• 4.1 渗透调节物质的合成
• 4.2 信号转导、转录与基因的表达调控
• 4.3 转运作用与离子平衡
• 4.4 抗氧化作用
• 4.5 保护和修复光合作用系统
• 4.6 胁迫相关蛋白与抗性
• 4.7 救援、防御蛋白
• 4.8 蛋白质合成与降解
• 4.9 其他途径
• 参考文献
• 第七章 差异表达数据的可靠性评价
• 1 前言
• 1.1 荧光实时定量PCR获得荧光信号的技术模式
• 1.2 定量mRNA的表达
• 1.3 荧光实时定量PCR技术的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方
• 2.2.1 标准样品的制备
• 2.2.2 目的基因片段的普通PCR扩增
• 2.2.3 荧光实时定量PCR检测
• 2.2.4 熔解曲线分析
• 3 结果与分析
• 3.1 标准样品标准曲线的建立
• 3.2 扩增曲线的建立
• 3.3 熔解曲线的建立
• 3.4 标准曲线的建立
• 3.5 验证qRT-PCR的方法和SSH结果的吻合性
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 第八章 结论与展望
• 1 本文研究总结
• 1.1 连香树干旱胁迫生理生化指标分析
• 1.2 连香树干旱胁迫抑制消减杂交文库的构建
• 1.3 连香树干旱胁迫差异表达基因功能分析
• 1.4 差异表达数据的可靠性分析
• 2 下一步工作的思路和方向
• 2.1 抗旱生理的研究
• 2.2 基因表达谱的完善
• 2.3 抗旱相关基因的克隆和进一步功能分析
• 参考文献
• 致谢
• 博士在读期间发表的论文