副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及初步应用

论文摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuls,HPs)是猪Glasser’s病的病原菌,临床上以纤维蛋白性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。HPs属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)。HPs是一种不运动、革兰氏阴性细小杆菌。近年来,随着我国规模化养猪场的发展,副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势,已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一,并给养猪业造成重大经济损失。本文从HPs的诊断、流行病学方面进行了系统研究,结果如下1、副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立。副猪嗜血杆菌培养条件比较苛刻,常规生化方法比较烦琐。本研究根据Oliveira等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性PCR引物序列,合成一对PCR引物,通过PCR反应条件的优化、特异性和敏感性的测定、及细菌DNA提取方法的选择,建立了一种快速、简洁、准确的PCR方法用于检测副猪嗜血杆菌。PCR扩增片段为编码16S rRNA的DNA片段,大小为822bp,最小检测量为1080个HPs细菌。与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌无特异性反应。用该法检测人工感染发病仔猪不同内脏组织悬液及自然感染仔猪肺组织,结果为:用来自试验感染猪的肺脏、心脏和肾脏抽提的DNA做模板,扩增的结果为阳性;而用试验感染猪的肝脏、脾脏、脑和来自自然感染猪的临床样品抽提的DNA做模板,扩增的结果为阴性。证明以肺脏组织为病料,通过细菌分离培养,再用PCR法鉴定分离菌体,可有效地用于HPs的诊断。2、副猪嗜血杆菌的流行病学调查对2005年11月份一2007年4月份送检的159个患病猪场仔猪肺脏进行了副猪嗜血杆菌分离培养和PCR鉴定,结果为该菌阳性76个,占48%。流行病学结果分析:该病发生与季节、猪的日龄和地区有关。该研究结果表明,副猪嗜血杆菌已在我国不同地区广泛流行。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一部分 研究进展
• 1. 病原学
• 1.1 生物学特性
• 1.2 血清型
• 1.3 致病因子
• 2 流行病学
• 2.1 血清学分型
• 2.2 基因分型
• 3 致病机理
• 4 诊断
• 5 防制
• 5.1 疫苗预防的研究进展
• 5.2 疫苗预防的临床应用
• 6 小结
• 第二部分 实验部分
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 细菌
• 1.3 试验动物
• 1.4 PCR 引物
• 1.5 副猪嗜血杆菌的复壮及纯化
• 1.5.1 复壮
• 1.5.2 纯化
• 1.6 细菌DNA 提取
• 1.6.1 应用细菌培养液提取DNA
• 1.6.2 病料组织中DNA 的提取
• 1.7 PCR 方法的建立
• 1.7.1 PCR 条件的优化
• 1.7.2 PCR 扩增
• 1.8 PCR 产物克隆与DNA 序列分析
• 1.8.1 PCR 产物胶回收
• 1.8.2 目的基因连接到pMD18-T Vector
• 1.8.3 制备感受态细胞
• 1.8.4 连接产物转化感受态细胞
• 1.8.5 阳性克隆筛选与鉴定
• 1.9 细菌DNA 提取方法的筛选
• 1.10 PCR 特异性试验
• 1.11 PCR 灵敏性试验
• 2 结果
• 2.1 副猪嗜血杆菌人工感染猪的临床表现和病理变化
• 2.2 副猪嗜血杆菌生物特性
• 2.3 PCR 扩增条件的确立
• 2.4 副猪嗜血杆菌16SrRNA基因的序列分析
• 2.5 细菌DNA 提取方法的选择结果
• 2.6 PCR 法的特异性
• 2.7 PCR 法的灵敏性
• 2.8 临床检测样品的选择
• 3 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介