水稻OsbolA1基因克隆与表达研究

论文摘要

生物体感知外界不利环境变化，通过信号转导网络传递信号，改变基因表达模式从而适应不利的外界环境，其中转录控制在生物对环境因子的应答反应中起着承上启下的作用。转录控制主要是通过转录因子作为反式作用因子与相应的基因启动子区域中的顺式作用元件或其它转录因子相互作用来调控胁迫应答反应。在动物、植物和微生物中已分离和鉴定了很多转录因子，其中BolA-like蛋白家族是近年来在原核生物中发现的一类转录因子，在原核生物中的初步研究表明BolA-like类转录因子与细胞壁形成、生物膜形成和细胞膜通透性有关，但在真核生物中BolA-like蛋白家族研究很少。本研究以水稻bolA同源基因为对象，对水稻BolA家族进行了序列分析，并对OsbolA1进行了基因克隆、原核表达及表型观察、以及OsBolA1蛋白在水稻中的亚细胞定位等研究，获得的主要结果如下：1．利用RT-PCR的方法得到了水稻OsbolA1的全长cDNA序列，并对其在水稻和拟南芥中的同源基因进行生物信息学分析。水稻和拟南芥中各有3和4个相关的同源基因，其中各有一个基因编码的蛋白还多含一个SufE结构域。水稻OsbolA1 cDNA含501bp的ORF，编码167aa，推导的氨基酸序列与大肠杆菌BolA有52％的同源性。2．以水稻根、茎、剑叶、愈伤等8种组织样品作为研究材料，利用半定量RT-PCR的方法研究了水稻OsbolA1基因在各组织的表达谱和表达规律，结果表明该基因在所有被检测的样品中均有表达，但在叶中表达量最高，这与拟南芥的同源基因研究结果一致，这表明水稻OsbolA1基因与拟南芥同源基因有相似的表达规律和功能。3．用半定量RT-PCR的方法研究了水稻OsbolA1基因在干旱、高盐、低温和3种激素处理下的表达量，结果发现水稻OsbolA1基因受干旱、高盐抑制表达，而受低温、ABA、KT、GA影响不明显，表现出一定的逆境相关性，这与原核同源基因在逆境下诱导表达不同，说明在真核生物和原核中bolA相关同源基因的表达模式存在多样性和种间差异。4．对水稻OsbolA1与GFP融合基因的表达产物进行亚细胞定位分析发现，融合蛋白主要定位于细胞核内。表明水稻OsBolA1蛋白主要在细胞核内发挥功能，可能作为转录调控因子起作用。5．构建了大肠杆菌bolA缺失突变体，并在大肠杆菌中表达出水稻OsBolA1融合蛋白，表型观察发现水稻OsBolA1蛋白可以部分互补大肠杆菌BolA蛋白的功能，表明水稻OsBolA1蛋白与大肠杆菌BolA蛋白有一定的结构相似性和功能相似性。这对深入研究真核生物中BolA-like蛋白的功能起到了一定的启示作用。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 1.文献综述
• 1.1 生物应答和适应逆境的一般机制
• 1.2 原核生物和真核生物的转录因子研究概况
• 1.2.1 转录因子概念
• 1.2.2 转录因子的调控机理
• 1.2.3 转录因子作用形式的复杂性
• 1.2.4 转录因子的分类
• 1.2.5 真核生物中与逆境相关的转录因子的研究情况
• 1.2.5.1 bZIP（basic-region leucine-zipper）蛋白
• 1.2.5.2 WRKY类转录因子
• 1.2.5.3 AP2/EREBP（APETAIdk2/Ethylene-Responsive Elemnt Binding Protein）转录因子
• 1.2.5.3.1 DREB类转录因子
• 1.2.5.3.2 ERF（Ethylene-Responsive-Element-Binding Factor）类转录因子
• 1.2.5.4 MYB类转录因子
• 1.2.6 原核生物中与逆境相关的转录因子的研究情况
• 1.2.6.1 HTH（helices-tum-helices）类转录因子
• 1.2.6.2 WH（wingedhelices）类转录因子
• 1.3 bolA研究进展
• 1.3.1 bolA的发现
• 1.3.2 bolA基因
• 1.3.3 BolA蛋白质结构特征
• 1.3.4 bolA的生物学功能
• 1.3.4.1 bolA与细胞形态
• 1.3.4.2 bolA与生物膜
• 1.3.4.3 bolA其它功能
• 1.3.5 小结
• 1.4 研究的目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻材料
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.2 主要仪器、试剂及溶液配制
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 水稻内源基因表达量分析的材料准备
• 2.3.3 水稻组织总RNA抽提,反转录
• 2.3.4 总RNA含量及纯度鉴定
• 2.3.5 水稻OsbolA1全长cDNA扩增
• 2.3.6 水稻OsbolA1 mRNA的组织分布和逆境表达谱
• 2.3.7 水稻OsBolA1蛋白的原核表达
• 2.3.7.1 原核表达载体的构建与鉴定
• 2.3.7.2 重组蛋白的表达
• 2.3.8 水稻OsBolA1的亚细胞定位
• 2.3.8.1 EFPG融合表达载体的构建与鉴定
• 2.3.8.2 农杆菌介导的水稻愈伤组织转化,抗性愈伤的筛选
• 2.3.8.3 组织切片
• 2.3.9 大肠杆菌BL21（DE3）-RP中bolA基因的敲除
• 2.3.10 水稻OsBolA1与大肠杆菌BolA功能互补
• 3.结果与分析
• 3.1 水稻BolA-like蛋白家族及OsbolA1序列分析
• 3.2 水稻OsbolA1全长cDNA的克隆
• 3.3 水稻OsboIA1 mRNA的组织分布和逆境表达谱
• 3.4 水稻OsBolA1蛋白的亚细胞定位
• 3.4.1 EGFP融合表达载体的构建与鉴定
• 3.4.2 水稻愈伤组织切片的观察
• 3.5 重组水稻OsBolA1蛋白原核表达
• 3.5.1 重组蛋白原核表达载体的构建与鉴定
• 3.5.2 重组蛋白的表达
• 3.6 水稻OsBolA1蛋白与大肠杆菌BolA蛋白的功能互补
• 4.讨论
• 4.1 真核和原核BolA蛋白序列的多样性
• 4.2 真核和原核BolA蛋白功能保守性
• 4.3 OsbolA1的表达模式与可能的功能
• 4.4 OsBolA1是否是属于转录因子
• 参考文献
• Protocol
• Protocol 1: TRIzol Reagent RNA Isolation Method
• Protocol 2: Reverse Transcription PCR
• Protocol 3: Agrobacterium-mediated transformation（for japonica only）
• Protocol 4: Plant histological protocol（For all tissue samples）
• 致谢