小麦（Triticum aestivum L.）高分子量麦谷蛋白1By15和1Dx1.5～t基因高效表达载体的构建及转化研究

论文摘要

高分子量麦谷蛋白是一类对小麦面粉的烘烤等品质有重要决定作用的种子贮藏蛋白。近年来,研究表明,1Bx14+1By15亚基组合同优良的面包、面条加工品质呈密切正相关,1Bx14+1By15组合的沉降值往往高于1Bx7+1By8。但在所有已分析的小麦品种中,HMW-GS-1By15的表达量远低于1Bx14的表达量。因此,本文在已克隆该亚基编码基因的基础上,从基因调控入手,研究Glu-1By15基因在种子发育过程中的表达变化规律,克隆和筛选胚乳特异表达的强启动子,构建载体,并进行小麦转化,为用分子手段进行小麦品质改良提供技术和科学依据。 对1Bx14+1By15携带者小偃54、小偃6号、陕优225和偃展1号籽粒HMW-GS蛋白和RNA进行提取和定量,发现无论翻译水平还是转录水平Glu-1Bx14的表达要明显高于Glu-1By15,并且在品种间存在一定的差异。对陕优225和小偃54两个品种中1By15基因组织和发育时间的表达特异性研究发现,Glu-1By15仅在胚乳发育特定时期表达,并且表达阶段和表达峰值在品种间存在差异。 根据已知的序列特征,用PCR法克隆了,1By15的部分启动子序列,并克隆了1Bx14,1By8,1Dx2和1Dy12等基因的启动子。序列分析表明HMW-GS基因的启动子序列同源性较高,都具有典型的HMW-GS基因启动子的序列特征,发现1Bx14的启动子序列具有明显的特异性。在启动子的瞬时转化实验中,它们操纵GUS基因表达的水平与其所操纵的结构基因（HMW-GS基因）表达水平结果相一致,即1By15的启动子活性低于1Bx14子的启动。此外我们还得到了能启动GUS强表达的Glu-1Dx2基因的启动子P2。 从烟草和水稻中成功克隆了两个已知的基质序列（MARs）。瞬时表达实验表明,仅在基因表达盒前侧加入MARs不能发挥其促进基因转录表达的作用,反而可能会对基因表达起到抑制作用。 利用内源强启动子P2（Glu-1Dx2基因的启动子）和MARs序列构建了1By15和1Dx1.5t基因的高效表达载体,用基因枪法和花粉管通道法进行了小麦转化研究。在对1By15的基因枪法转化中,共转化质粒pUC-MT2-15和pACH20的转化效率明显高于pCAB2-15。Southern杂交证明有4个转基因品系（T0）有1By15基因的插入;SDS-PAGE检测到6个T1株系中目的蛋白成功表达。 通过花粉管通道法进行1By15的转化,只有pCAB2-15载体得到了56个PCR检测为阳性的独立株系。Southern杂交证明有2个转基因品系（T1）有1By15基因的插入;经SDS-PAGE检测有6粒（T2）种子得到了目的蛋白的表达。发现该基因的导入可能干扰了受体品种原有种子蛋白基因的表达,但Western杂交分析证明,转化籽粒低分子量区出现的一些未知蛋白（可能）并不是高分子量谷蛋白的变异体。 对于1Dx1.5t基因的转化,PCR初步鉴定表明基因枪法转化率平均为1.9%。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦遗传转化的研究进展
• 1.1.1 小麦遗传转化研究概况
• 1.1.2 小麦遗传转化的主要方法及其问题
• 1.1.3 基因表达调控元件及载体构建策略
• 1.1.4 外源基因的表达与遗传
• 1.2 HMW-GS的相关研究及其进展
• 1.2.1 HMW-GS与小麦加工品质
• 1.2.2 评价小麦加工品质的指标
• 1.2.3 遗传模式
• 1.2.4 小麦HMW-GS的结构
• 1.2.5 高分子量麦谷蛋白的分离与基因克隆
• 1.2.6 HMW-GS与加工品质关系的研究
• 1.3 HMW谷蛋白基因的表达调控
• 1.3.1 高分子量麦谷蛋白亚基基因上游调控序列的研究
• 1.3.2 谷蛋白基因组织特异性表达的调控
• 1.3.3 HMW-GS基因表达水平影响因子的研究
• 1.4 HMW-GS基因的转化研究
• 1.4.1 HMW-GS转基因小麦的功能分析
• 1.4.2 HMW-GS基因或启动子导入其它种属的研究
• 1.4.3 小麦近缘种属高分子量麦谷蛋白基因转化普通小麦
• 1.5 本论文研究的目的和意义
• 第二章 HMW-GS 1By15基因的表达分析
• 2.1 1Bx14和1By15翻译和转录水平表达差异的比较分析
• 2.1.1 材料和方法
• 2.1.2 结果
• 2.2 1By15基因在不同组织和胚乳发育时期的表达情况
• 2.2.1 材料和方法
• 2.2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 HMW谷蛋白基因的组织特异性表达调控
• 2.3.2 1By15基因的表达调控
• 第三章 HMW-GS基因启动子和MARs序列的克隆及GUS瞬时表达分析
• 3.1 高分子量麦谷蛋白基因部分启动子序列的克隆与分析
• 3.1.1 材料和方法
• 3.1.2 结果与讨论
• 3.2 高分子量麦谷蛋白基因启动子的瞬时转化实验
• 3.2.1 材料和方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.3 讨论
• 3.3 水稻和烟草MAR序列的克隆与瞬时转化实验
• 3.3.1 材料和方法
• 3.3.2 结果
• 3.3.3 讨论
• t高效表达载体的构建与转化'>第四章 小麦HMW-GS 1By15和1Dx1.5^t高效表达载体的构建与转化
• 4.1 小麦HMW-GS 1By15两个表达载体的构建与普通小麦的转化
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.3 结果与分析
• t高效表达载体的构建与小麦转化'>4.2 小麦HMW-GS 1Dx1.5^t高效表达载体的构建与小麦转化
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.2.3 结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 两种转化方法的比较
• 4.3.2 载体构建策略对基因表达的影响
• 4.3.3 共转化法的优势
• 4.3.4 转基因过程中的基因沉默
• 4.3.5 转基因株系的品质预测
• 第五章 结论
• 5.1 HMW-GS 1By15表达的研究
• 5.2 HMW-GS基因启动子及MARs序列的克隆和GUS瞬时表达实验
• 5.3 小麦HMW-GS 1By15高效表达载体的构建与转化
• t高效表达载体的构建与转化'>5.4 粗山羊草HMW-GS1Dx1.5^t高效表达载体的构建与转化
• 参考文献
• 主要试剂的配制
• 致谢
• 作者简历