应激刺激诱导p38 MAPK核移位的分子机制研究

论文摘要

细胞信号特异性传递过程取决于信号发生和传递的时间和空间特征。信号蛋白的亚细胞定位和激活后移位是信号传递的主要空间特征。在许多情况下,信号蛋白需要锚定于适配体蛋白、细胞骨架及细胞膜结构,或与其上游激酶和下游底物结合来发挥正常功能。信号分子的特异性定位有助于细胞高效经济地完成各种正常功能和病理反应。因此,蛋白的细胞内定位研究已成为目前国际上细胞信号转导研究最重要的内容之一。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导系统,普遍存在于包括酵母和哺乳动物在内的多种生物。MAPK家族包括ERK、JNK、p38和ERK5/BMK1四个亚家族。MAPK的底物包括转录因子、胞内蛋白激酶、骨架相关蛋白、离子通道蛋白等。MAPK家族成员在细胞中都具有特定的定位,且观察到在适宜的刺激下,多个MAPK家族成员移位入核的现象。MAPK的细胞内定位和激活后移位,以及对上游激酶和下游底物的选择性作用是激酶级联信号特异性转导的重要机制。p38信号通路主要在炎症和应激反应中起作用。致炎细胞因子、细菌成份、紫外线照射、细胞外高渗、H2O2和热休克等刺激都能激活p38通路。我们的前期研究发现,p38在细胞中弥散分布,且在LPS刺激后能迅速移位入核并诱导TNF-α的表达。然而,这种核移位是一个短暂的过程,在信号被灭活后p38将重新分布于胞质中。当阻断p38的移位时,信号的传导也将被阻断,这表明正常的p38信号转导需要通过其移位来完成。尽管对于p38的细胞内定位情况和激活后移位已有一些报道,然而由于实验方法的差异和技术手段的限制,不同研究者对于p38定位与移位机制的研究结果大相径庭。多种因素都可能参与p38定位与移位的调节。在某种疾病状态或刺激作用下,对于特定的细胞类型,哪种机制参与调节这一过程,尚未阐明。因此,在文献报道和本实验室前期研究工作的基础上,我们拟研究不同刺激性质和时间以及在不同细胞系中p38的细胞内定位情况,p38的磷酸化和激酶活性以及其上游激酶MKK6、下游底物MK2和PRAK对其细胞内定位的影响;研究对微管、微丝或马达蛋白的干预对p38细胞内定位的影响;以及利用出核抑制剂和入核抑制剂来分别观察对p38出、入核的影响。我们首先验证了p38在受到应激刺激后能被显著磷酸化并移位入核,随后用多种不同刺激条件,包括UV、anisomycin、LPS、H2O2、sobitol对细胞进行处理,发现都有p38移位入核现象的发生,说明各种能够活化p38 MAPK的应激刺激均可以使p38核移位。而且,多种细胞系中都可观察到p38受到刺激后的移位现象,这些结果说明了p38激活后的核移位在真核动物细胞中是一个普遍现象。我们还观察了p38核移位过程的时间点。在细胞受到短暂的应激刺激后,p38被磷酸化并逐渐转移至胞核,在60 min左右达到高峰,之后逐渐出核,在240 min时回到静息水平。倘若刺激因素持续作用于细胞,则p38磷酸化水平持续增加并始终聚集在核内而不出核。这提示p38的入核依赖于磷酸化而出核依赖于去磷酸化。利用p38不同突变体进行的研究表明,p38（AF）的胞内定位在刺激后不发生改变,失去了移位入核的能力,而p38（KM）不受影响,说明p38在刺激后的核移位确实是磷酸化依赖的,而且不依赖于其激酶活性。利用不同MAPK通路抑制剂预处理细胞后,对p38的移位入核都没有阻断作用,这再次证实了p38的移位入核与其自身的激酶活性没有关系。随后我们进一步探讨了p38上游激酶和下游底物对其细胞内定位的影响。结果表明,p38的移位入核不但依赖于MKK6对其的磷酸化,而且MKK6的细胞内定位还能影响p38在细胞内的定位情况。p38下游底物MK2的定位可以决定p38的细胞内定位,可能是作为p38的锚定蛋白发挥作用。p38另一个下游底物PRAK对p38核移位的影响与MK2类似。这些结果说明p38在应激刺激后的移位还与其上游激酶、下游底物的细胞内定位都有着密切的关系。我们的前期研究提示细胞骨架可能参与了p38移位入核这个迅速而有序的过程。我们利用不同的细胞骨架相关功能抑制剂对细胞进行预处理,结果发现利用微管破坏剂nocodazole预处理细胞后,p38的移位入核被阻断,说明p38的激活和移位入核都需要功能正常的微管系统,而微丝系统没有明显作用。而且,p38的激活后移位与动力蛋白相关而且是能量依赖性的,而与肌球蛋白没有明显关系。我们分别观察了典型的入核抑制剂WGA和出核抑制剂LMB对p38出、入核的影响。结果发现,细胞分别用WGA或LMB预处理后,并不能阻断p38的入核或出核。总之,我们利用定点突变、荧光蛋白报告基因和免疫荧光等技术研究了应激刺激时p38的细胞内定位和激活后移位的影响因素,得到了如下结论:1)不同类型的刺激都可引起p38的激活后移位;p38的激活后移位广泛存在于不同细胞系中;p38受到刺激后60 min移位达到高峰,随后又逐渐回到静息水平;2) p38的激活后移位由其磷酸化决定,而与其激酶活性无关;3) p38的上游激酶MKK6、下游底物MK2和PRAK都能影响p38细胞内定位;4)干预微管和动力蛋白以及抑制能量供应可阻断p38的激活后移位,而干预微丝和肌球蛋白没有影响;5) p38的出核依赖于去磷酸化;6)出核抑制剂LMB和入核抑制剂WGA对p38的出、入核没有影响。综上所述,我们通过研究证实了p38在应激刺激下的核移位是一个动态平衡且取决于其自身磷酸化状态的能量依赖过程,微管系统和动力蛋白参与了此过程,且p38通路的上游激酶和下游底物能对其胞内定位产生影响。这些问题的阐明为我们认识p38在刺激下移位入核的具体机制提供了重要的实验证据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1.第一章 前言
• 2.第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 试剂配制
• 2.1.3 质粒、菌株和细胞株
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 突变载体的构建
• 2.2.2 细胞培养与转染
• 2.2.3 免疫荧光
• 3.第三章 结果
• 3.1 突变体的构建
• 3.2 p38细胞内定位的改变及上游激酶和下游底物对其定位的影响
• 3.3 p38 MAPK移位入核与细胞骨架成分的关系
• 3.4 p38 MAPK出、入核的影响因素
• 4.第四章 讨论
• 5.第五章 小结
• 6.参考文献
• 7.综述
• 8.发表文章
• 9.英文缩略词表
• 10.致谢