氢气生物学效应系列研究

论文摘要

氢是自然界最简单的元素,氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。氢气的溶解度比较低,且不能被机体大量吸收,所以,人们一直没有重视氢在高等生物体内的作用。在辐射化学领域,曾有人证明在溶液中氢气可与羟自由基直接反应（JPhys Chem.1988）,但这没有受到生物学家重视。科学家曾试图证明高压情况下,氢气或许可与氧或高活性自由基发生反应,但研究并没有获得该反应存在的直接证据（Undersea Hyperb Med. 1994）。因此,大部分生物学家一直认为,氢气属于生理性惰性气体。2007年国际上首次报道,动物呼吸2%的氢可有效治疗脑缺血再灌注损伤。继而,我们前期实验研究率先发现,腹腔注射含氢盐水也能非常有效治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤。虽然选择性抗氧化是氢治疗作用的可能机制,但在机体内氢的具体作用机制尚不清楚,氢气对其它缺血损伤是否具有类似的保护作用亦未知。因此,本课题先后采用3种不同的损伤模型（心肌缺血再灌注损伤,氧中毒肺损伤和一氧化碳迟发型脑损伤）,寻找氢气选择性抗氧化作用的在体依据及可能机制,从而为进一步深入研究氢气治疗缺血性疾病的内在机制,开发利用氢作为临床药物,评价氢的生物学作用奠定基础。目前,血管再通、恢复血流是治疗急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）临床上最有效和普遍的手段。尽管恢复血流非常关键,呼吸爆发可以激发ROS的产生从而导致细胞毒作用。活性氧的大量产生不可避免的驱动了细胞坏死和凋亡相关的信号通路的激活,此为致死性再灌注损伤。50%以上的最终梗死面积归因于再灌注损伤,因此减少再灌注损伤是保护心肌的一个重要靶点。本课题在于证实简单易用、安全和经济的氢饱和生理盐水对于心肌缺血再灌注损伤是否具有保护作用。我们通过评估注射氢饱和生理盐水24小时后心肌梗死面积、氧化应激水平和心功能,对机制进行初步探讨。氧中毒急性肺损伤（Hyperoxic acute lung injury, HALI）是由长时程的高浓度氧吸入引起（氧分压超过50%）。目前认为,高分压氧引起活性氧增加,驱动氧化损伤是氧中毒的关键因素。我们前期的研究发现,氢是一种新的抗氧化物质,可以有效减少氧化应激和炎症反应。因此,本课题采用大鼠慢性氧中毒模型,氢饱和生理盐水注射,肺脏损伤指标以及相关氧化指标和炎症指标的测定,研究氢对氧中毒的影响,以期初步明确氢的作用机制,为防治氧中毒提供新的手段和实验依据。一氧化碳（CO）中毒是目前困扰全球毒理学家、重症监护医生、急症医生最常见的毒性气体损伤导致的疾病之一。CO中毒的临床症状经常是非特异性、多种多样的。超过半数的存活者在CO中毒后的3天到4周内会发生认知障碍。CO中毒的病理生理过程与低氧、兴奋性氨基酸上升和氧化应激相关。中性粒细胞、线粒体和黄嘌呤氧化酶产生的活性氧簇引起脂质过氧化,最终导致迟发型神经损伤的发生。本研究的目的旨在验证氢气治疗减少CO迟发型脑病的推测,评估氢气治疗大鼠严重急性CO中毒脑病的有效性。第一部分、氢饱和生理盐水对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用方法:1、采用大鼠冠状动脉左前降支暂时阻断30 min,之后恢复冠状动脉血供复灌注24 h的方法建立大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型。2、再灌注24 h后,经右颈总动脉插入PE导管检测大鼠左心室心功能参数。3、再灌注24 h后,1%TTC,37 oC,心肌切片染色15 min并固定,检测大鼠心肌梗死面积。4、苏木精-伊红染色（H&E）对心肌进行组织病理学评分。5、取心肌缺血区组织匀浆标本和血浆标本,进行丙二醛（MDA）含量检测,检测心肌缺血区组织Caspase-3水平的表达。6、免疫组化检测8羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）的表达和分布,TUNEL法检测心肌细胞凋亡的情况。结果:1、与缺血再灌注组和缺血再灌注+生理盐水注射组相比,再灌注5分钟前单次腹腔注射氢饱和生理盐水（5ml/Kg）可以明显改善心肌缺血再灌注损伤引起的心功能下降（P<0.05）。2、氢水治疗可以明显较少心肌梗死面积（P<0.05）,组织学分析显示氢水治疗组心肌缺血区细胞坏死和出血显著减少,TUNEL染色显示心肌细胞凋亡数减少。3、氢水治疗组心肌缺血区组织和血浆中氧化损伤指标MDA明显减少,凋亡酶Caspase-3在心肌缺血组织中表达亦减少（P<0.05）。4、氢水治疗可以降低再灌注损伤引起的DNA损伤指标8-OHdG的表达。第二部分、氢饱和生理盐水对氧中毒肺损伤的预防作用方法:1、建立大鼠慢性氧中毒模型（氧舱持续暴露60 h,98%纯氧吸入）2、检测肺脏湿干比和胸膜腔渗出液含量,肺组织切片HE染色观察肺脏形态学改变。3、检测氧化应激指标MDA和SOD在肺脏组织匀浆中的表达。4、ELISA法检测肺组织TNF- a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表达。5、TUNEL染色检测肺脏细胞凋亡的变化。结果:1、氢气可以有效预防氧中毒肺损伤,减少肺脏湿干比和胸膜腔渗出液,肺组织切片HE染色提示氢气治疗可明显减少肺水肿、充血、肺泡内出血,炎细胞浸润。2、SOD、MDA和8-OHdG在氢气治疗组表达量均减少,提示氢气治疗可以有效减少氧化应激。3、氢气治疗可以有效减少肺脏中TNF- a、IL-1b和MPO的表达。4、TUNEL染色提示氢气治疗组相比对照组和生理盐水组肺泡上皮和内皮细胞凋亡数量明显减轻。第三部分、氢饱和生理盐水对一氧化碳中毒迟发型脑病的治疗作用方法:1、建立大鼠CO中毒模型,大鼠在动物舱内持续40 min吸入1000 ppm浓度CO,之后20 min持续吸入3000 ppm浓度CO至昏迷后出舱。2、CO中毒后9天,经主动脉灌流4%多聚甲醛固定大鼠,取脑,尼氏染色检测皮层和海马神经元的形态学改变。3、免疫荧光方法检测脑中小胶质细胞活化情况（Iba1的表达水平）,免疫组化检测髓磷脂基础蛋白（MBP）在皮层和海马中的表达。4、ELISA法检测大脑组织TNF- a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表达。5、Morris水迷宫检测认知功能在不同处理组的差异。结果:1、与对照组相比,氢气治疗组皮层和海马CA1区尼氏阳性细胞明显减少。2、氢气治疗可以有效减少CO中毒后脑中小胶质细胞抗原Iba1的表达,同时氢气治疗组MBP降解亦减少。3、氢气治疗组大脑海马和皮层中TNF- a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表达相比对照组明显降低。4、通过水迷宫检测,提示氢气治疗可以明显改善CO中毒导致的认识功能障碍。小结1、氢饱和生理盐水可以显著提高大鼠缺血损伤后心功能的恢复。此种作用可能与氢气的自由基清除作用有关。2、氢饱和生理盐水可以通过抗氧化和抗炎来减轻急性氧中毒肺损伤。3、腹腔注射氢饱和生理盐水可以在组织学和功能学上改善大鼠一氧化碳中毒脑病的预后。氢盐水有望成为一种治疗严重CO中毒脑病的新的替代疗法。其作用机制可能与氢气的抗氧化和抗炎作用相关。4、氢气是一种对在细胞和器官保护中具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的重要生理调节因子。需要进一步的研究来证实其临床上对治疗氧化损伤疾病的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分、氢饱和生理盐水对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第二部分 氢饱和生理盐水对氧中毒肺损伤的预防作用
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第三部分、氢饱和生理盐水对一氧化碳中毒迟发型脑病的治疗作用
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 综述一 氢气作为治疗性医学气体的研究进展
• 参考文献
• 综述二 缺血预适应和后适应的触发因子
• 参考文献
• 在读期间论文发表和科研工作情况说明
• 致谢