蜈蚣小分子多肽类有效部位的分离纯化及抗肿瘤活性筛选

论文摘要

目的：研究胰蛋白酶酶解法及丙酮沉淀法提取蜈蚣的最佳工艺条件,并检测分离纯化的多肽类有效部位抗肿瘤活性。方法：1.采用L9（34）正交设计法,取胰酶用量、酶解温度和酶解时间三个因素,各取三个水平,并结合丙酮沉淀法制备蜈蚣多肽类有效部位粗提物。以提取率为指标结合MTT法检测各粗提物对人肝癌HepG2细胞的IC50筛选出最佳提取工艺条件。2.采用Sephadex G-25凝胶过滤层析对最佳工艺所得粗提物进行分离纯化,采用MTT法检测纯化物对HepG2细胞、Bel-7042细胞和A549细胞的增殖抑制作用,高效液相色谱检测最有效部分的成分情况,Hoechst荧光染色法观察HepG2细胞凋亡形态,流式细胞术检测细胞凋亡与周期。结果：1.胰蛋白酶酶解法最佳工艺为：2.0g蜈蚣超微粉,胰酶量为0.1g,酶解温度为46℃,酶解时间为4h。2.经Sephadex G-25凝胶过滤层析分离得到三部分,其中第二部分对肝癌HepG2细胞Bel-7042和A549细胞杀伤作用最大。3.与阴性对照组比较,纯化物A2作用后的HepG2细胞周期表现为GO/G1期细胞比例下降,G2/M期细胞比例均升高,差异有显著统计学意义（P<0.01）。结论1.本研究验证了利用酶解法、凝胶层析分离纯化工艺提取蜈蚣小分子多肽类有效部位的可行性。2.所筛选出的蜈蚣小分子多肽类有效部位纯化物A2具有显著的体外抗肿瘤活性。3.所筛选出的蜈蚣小分子多肽类有效部位纯化物A2可通过诱导细胞凋亡,使细胞停滞于G2/M期,减少有丝分裂,从而抑制肿瘤生长。关键字：蜈蚣；提取工艺；正交设计；分离纯化；抗肿瘤

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 蜈蚣酶解法提取工艺优化
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞株来源
• 1.2 药物及试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 实验方法
• 2 结果
• 第二部分 蜈蚣小分子多肽类有效部位的分离纯化及抗肿瘤活性筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞株
• 1.2 药物及试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 实验方法
• 1.5 统计学方法
• 2 结果
• 2.1 sephadex G-25凝胶层析色谱图
• 2.2 分离纯化的小分子多肽类各有效部位的多肽含量测定
• 2.3 纯化物A1、A2、A3对HepG2细胞、Be1-7042和A549细胞增殖抑制作用的影响
• 2.4 C18反相高效液相对A2的成分情况考察
• 2.5 纯化物诱导HepG2细胞凋亡及对细胞周期的影响
• 2.6 荧光显微镜下HepG2细胞的凋亡形态
• 第三部分 讨论
• 1 蜈蚣抗肿瘤研究
• 2 蜈蚣提取方法研究
• 3 蜈蚣有效成分的分离与纯化
• 3.1 凝胶过滤层析在动物类药中的应用
• 3.2 蜈蚣有效成分分离与纯化
• 4 筛选出的小分子多肽类组分对人肝癌HepG2细胞生物学行为的影响
• 5 进一步研究与展望
• 结论
• 致谢
• 附录1 文献综述
• 参考文献
• 附录2 攻读硕士学位期间的主要成果