论文摘要
目的:本研究拟采用分子生物学和分子免疫学的方法构建卡氏肺孢子菌（Pneumocystis carinii, PC） p55-v3 DNA疫苗,同时将p55-v0抗原作为阳性对照,免疫SD大鼠后,对p55-v3 DNA疫苗预防PC的作用进行评定,并进一步对其免疫作用机理进行探讨,为阐明PC与宿主相互作用的分子机制及新型疫苗的研制提供基础,进而为PCP的防治提供一种新的方法和手段。方法:1.建立PCP动物模型并制备PC抗血清。2.提取PC感染鼠肺组织总RNA,运用RT-PCR扩增p55-v3和p55-v0抗原基因。3.运用分子克隆的方法构建p55-v3和p55-v0的真核表达载体。4.运用脂质体2000将鉴定正确的真核表达载体转染COS-7细胞,通过RT-PCR和Western-blot分别在mRNA及蛋白水平对所转染细胞两种抗原蛋白的表达进行检测。5.动物实验:分别将p55-v3、p55-v0 DNA疫苗免疫SD大鼠（以pVAX1空载体及PBS作为对照）后,按常规方法构建PCP模型,于第6周处死大鼠,通过一般情况、肺重/体重、肺印片包囊计数、病理切片及体液免疫、细胞免疫的检测,观察p55-v3和p55-v0 DNA疫苗对大鼠的免疫保护作用并进行比较,从而对p55-v3的免疫保护机制及效应进行评价。结果:1.模型鼠肺印片（GMS染色）,可见大量被染成棕黑色的PC包囊。免疫组化证实血清中抗PC抗体阳性。2.以总RNA为模板进行RT-PCR后,1 %琼脂糖凝胶电泳分析,在1200 bp、1000 bp左右处见一特异性条带,分别与p55-v0、p55-v3抗原基因大小相符。3.将扩增产物与T载体连接,测序正确后构建重组载体pVAX-p55-v0,pVAX-p55-v3。酶切鉴定表明p55-v3、p55-v0抗原基因片段已成功克隆入pVAX1载体。4.将重组真核表达载体转染COS-7细胞后提取总RNA,以其为模板进行RT-PCR,1 %琼脂糖凝胶电泳观察可见重组质粒转染组有明显的特异性条带,分别位于1200 bp及1000 bp左右,其大小与p55-v0及p55-v3基因片段一致,而空质粒转染组仅见内参（GAPDH）条带,未见特异性条带;Western-blot分析发现重组质粒转染组均可见约55 kDa大小的特异性条带,提示在COS-7细胞中重组质粒从mRNA及蛋白水平均有表达。5.构建的DNA疫苗免疫SD大鼠后发现pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫组肺重/体重、包囊计数较PBS及pVAX1空载体组明显减少,而pVAX-p55-v0与pVAX-p55-v3免疫组之间无显著性差异。病理切片观察发现PBS及pVAX1空载体组（HE染色）肺泡间隔增宽,间质水肿明显,GMS染色下可见肺泡壁及间质中大量被染成棕黑色的PC包囊,而pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫组明显减轻,且pVAX-p55-v0与pVAX-p55-v3之间无显著性差异。与对照组相比,免疫组血清IgG显著增高,脾淋巴细胞显著增殖,血清IFN-γ,IL-2增高明显,pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫组之间无明显差异。各组大鼠血清IL-4水平无显著性差异,结论:1.成功构建PCP模型并制备PC抗血清。2.成功扩增p55-v0及p55-v3基因。3.成功构建重组真核表达载体pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3。4.重组真核表达载体pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3体外转染COS-7细胞,RT-PCR及Western-blot鉴定证实在mRNA及蛋白水平均有表达。5.重组DNA疫苗pVAX-p55-v3可诱导大鼠产生部分保护性免疫应答,其免疫保护效应与p55-v0 DNA疫苗无显著性差异。