耐盐粘球菌的社会学行为及其对海洋环境的适应策略

论文摘要

粘细菌曾经被普遍认为是典型的陆生细菌，不能够在海水盐浓度下生长。然而随着研究的深入，人们利用分子生物学手段(16S rDNA文库技术)从许多海洋环境样品中检测到了粘细菌的存在。并从1998年开始，研究者从太平洋附近的海洋环境中越来越多的分离纯化出活的粘细菌菌株，“海洋粘细菌”的概念在国际上被认同并引起人们极大关注。根据耐盐能力的不同，海洋粘细菌通常被分为两类：海洋嗜盐粘细菌和海洋耐盐粘细菌，它们都能够在海洋环境条件下生存并繁殖，但是在形态、系统分类、生理生化特性以及生活模式上有很大差异。 粘细菌以具有复杂的多细胞社会学行为著称，它们能够在营养丰富的条件下在固体表面上滑行运动；又能在饥饿的条件下聚集形成子实体结构以及抗逆性的粘孢子。粘细菌的社会学行为主要依赖于其双运动系统，包括Social motility(S运动)和Adventurous motility(A运动)两个运动系统。在柔软湿润的琼脂表面(0.3％琼脂浓度)上，主要表现S运动；在坚硬干燥的琼脂表面(1.5％琼脂浓度)上，主要表现A运动，并辅以少量S运动的协同作用。 社会学行为的存在(主要体现在双运动系统的维持)使得粘细菌能够在各种各样复杂的生理和生态环境中生存繁殖。那么是否社会学行为的存在也给粘细菌在海洋环境中的适应生存提供了一个优势?海洋粘细菌是怎样适应海洋环境生存繁殖的?这成为一个令人感兴趣并且富有挑战性的课题。 本文工作中，我们从多种海洋样品中分离纯化了多株海洋粘细菌，对它们进行了初步的形态学观察与分析之后，研究其在海水条件下的社会学行为及适应机制。在国际上首次揭示了海水条件下海洋粘细菌社会学行为变化的规律，并利用芯片技术从分子水平上研究该变化的机理，为理解社会学行为(主要是双运动系统的维持)在粘细菌适应海洋环境中的必要性与重要意义提供了重要信息。 综合文献表明，海洋粘细菌在地球上的分布具有明显的区域特异性。目前除了印度洋附近没有海洋粘细菌的研究之外，太平洋附近分离纯化到大量的海洋嗜盐粘细菌和海洋耐盐粘细菌，而大西洋和北冰洋区域粘细菌的出现机率很小，至今为止仅利用16S rDNA文库构建方法检测到粘细菌的存在。本工作利用本实验室创立的海洋粘细菌分离纯化方法，对从中国沿海地区黄海、东海沿岸收集的多

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章：文献综述
• 1.1 粘细菌的生态学研究
• 1.1.1 粘细菌的主要栖息地
• 1.1.2 极端生境下的粘细菌
• 1.1.2.1 泥炭沼
• 1.1.2.2 寒冷生境
• 1.1.2.3 炽热生境
• 1.1.2.4 高海拔生境
• 1.1.2.5 盐环境
• 1.1.2.6 厌氧环境
• 1.2 海洋粘细菌的研究背景
• 1.3 粘细菌的双运动系统
• 1.3.1 粘细菌双运动系统的概述
• 1.3.2 粘细菌S运动和A运动的运动机制
• 1.3.2.1 S运动系统
• 1.3.2.1.1 Type Ⅳ pili
• 1.3.2.1.2 Fibrils
• 1.3.2.1.3 LPS O-antigen
• 1.3.2.2 A运动系统
• 1.3.3 双运动系统的功能
• 1.3.3.1 鞭毛细菌
• 1.3.3.2 滑行运动细菌
• 1.3.4 粘细菌双运动系统相关基因及其功能描述
• 1.3.4.1 S运动和A运动共同必需的基因
• 1.3.4.2 S运动相关基因
• 1.3.4.2.1 Tfp相关基因
• 1.3.4.2.2 Fibrils相关基因
• 1.3.4.2.3 LPS O-antigen相关基因
• 1.3.4.3 A运动相关基因
• 1.3.4.4 其他滑行运动相关基因
• 1.4 粘细菌的社会学行为
• 1.4.1 固体表面滑行运动
• 1.4.2 子实体形态发生
• 1.5 本文工作开展的思路
• 第二章：耐盐粘球菌的分离纯化与分类鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 样品
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 分析软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 海洋粘细菌的分离纯化方法
• 2.2.2 海洋粘细菌的形态学观察
• 2.2.3 粘细菌染色体DNA的提取方法
• 2.2.4 16S rDNA序列扩增
• 2.2.5 16S rDNA测序与分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 海洋粘细菌的分离纯化
• 2.3.2 海洋粘细菌的特异性区域分布
• 2.3.3 海洋粘细菌的形态学观察
• 2.3.4 海洋粘细菌的耐盐能力分析
• 2.3.5 耐盐粘球菌的16S rDNA系统分类
• 2.3.6 耐盐粘球菌的子实体形态发生
• 2.4 本章小结
• 第三章：耐盐粘球菌社会学行为的表型观察
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 仪器与分析软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞在软硬琼脂上的滑行运动观察
• 3.2.2 单个细胞运动速率的观察
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 海水对非耐盐粘球菌滑行运动的影响
• 3.3.2 海水对不同耐盐粘球菌滑行运动的影响
• 3.3.3 不同海水浓度对耐盐粘球菌滑行运动的影响
• 3.3.4 贫瘠培养基和营养培养基上的滑行运动差异
• 3.3.5 软硬琼脂实验中的几条经验
• 3.3.6 耐盐粘球菌运动速率的检测
• 3.4 本章小结
• 第四章：耐盐粘球菌社会学行为的机理研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂与试剂盒
• 4.1.4 实验器材与仪器
• 4.1.5 分析软件
• 4.2 方法
• 4.2.1 细胞表面结构的透射电镜观察
• 4.2.2 利用Microarray技术研究耐盐粘球菌运动相关基因的表达谱
• 4.2.2.1 序列分析
• 4.2.2.2 引物设计
• 4.2.2.3 粘细菌基因组DNA的提取
• 4.2.2.4 靶DNA的PCR扩增及产物纯化
• 4.2.2.5 Microarray的制备
• 4.2.2.6 芯片质量检测与比较基因组杂交
• 4.2.2.7 粘细菌总RNA的提取
• 4.2.2.8 DNase I消化RNA提取物
• 4.2.2.9 cDNA反转录条件的优化
• 4.2.2.10 cDNA反转录合成及纯化
• 4.2.2.11 基因组DNA／cDNA产物的荧光标记
• 4.2.2.12 芯片杂交与洗涤
• 4.2.2.13 芯片杂交结果的检测与分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 耐盐粘球菌细胞表面结构的透射电镜观察
• 4.3.1.1 不同耐盐粘球菌的Tfp观察结果
• 4.3.1.2 高耐盐粘球菌HW-1在不同条件下的细胞表面结构观察结果与分析
• 4.3.1.3 利用TEM观察粘球菌细胞表面结构的几条经验
• 4.3.2 利用Microarray技术分析高耐盐粘球菌HW-1运动相关基因的表达谱
• 4.3.2.1 粘球菌运动相关基因的序列分析
• 4.3.2.2 芯片制备所需的运动相关基因引物设计与合成
• 4.3.2.3 靶DNA的PCR扩增结果
• 4.3.2.4 总RNA提取结果
• 4.3.2.5 芯片质量检测与比较基因组杂交
• 4.3.2.6 反转录条件的优化与确定
• 4.3.2.7 Microarray数据的归一化处理（Normalization）
• 4.3.2.8 淡水与海水条件下耐盐粘球菌HW-1运动相关基因的差异表达
• 4.3.2.9 淡水与海水条件下耐盐粘球菌HW-1中显著差异表达基因的分析
• 4.4 本章小结
• 结束语
• 附录
• 附录一：S运动系统相关基因信息统计表
• 附录二：A运动系统相关基因信息统计表
• 附录三：用于表达芯片制备的60个运动相关基因片段的引物
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表