人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒疫苗研制、中和抗体筛选及冷冻电镜三维结构重建

论文摘要

高危型人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）病毒感染被认为是引起女性宫颈癌的主要原因。流行病学调查显示98%的宫颈癌都是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起,其中约70%是由HPV16或HPV18引起。因此,开发一种安全,有效的HPV18疫苗对于预防宫颈癌具有重大的意义。首先,本研究构建了高效HPV18L1蛋白大肠杆菌原核表达系统。利用该表达系统,HPV18 L1蛋白能够以可溶性形式表达,保留了其天然的表位。其次,本研究还还针对大肠杆菌来源的HPV18 L1蛋白建立了一套高效,易于放大的纯化工艺,以及类病毒颗粒体外组装工艺。根据该工艺所制备的HPV18VLPs疫苗纯度达到98%以上,各项鉴定指标均符合药典要求。且动物实验显示,该疫苗具有高度的免疫原性,在实验动物体能能诱导高滴度的HPV18中和抗体。本研究在成功制备HPV18 VLPs疫苗的基础上,利用假病毒中和模型,一共鉴定出HPV18中和单抗6株,而后通过阻断实验进一步确定了优势中和单抗11A9以及3C3。为了进一步阐明11A9单抗的中和机制,结合位点,在本研究对HPV18 VLPs进行了冷冻电镜观测,初步了解HPV 18 VLPs的结构模式。此外,还进一步制备了11A9-HPV18 VLPs抗原抗体复合物以备进一步进行冷冻电镜研究。总之,本研究利用大肠杆菌表达系统制备了一种廉价,有效的HPV18 VLP疫苗,对HPV18的中和单抗进行鉴定,并且对于HPV18优势单抗11A9的中和机制,结合位点进行了初步探索,为将来进行HPV18疫苗的分子设计提供了参考。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、HPV病毒概述及研究进展
• 1.1.HPV概述
• 1.2.人乳头瘤病毒的分子生物学特点
• 1.2.1.HPV的基因组及编码的蛋白
• 1.2.2.HPV颗粒的主要形态结构
• 1.2.2.1.HPV L1的主要抗原表位
• 1.2.2.2.HPV L2的主要抗原表位
• 1.2.3.HPV的感染和复制机制的研究
• 1.2.4.人乳头瘤病毒引发的相关疾病
• 1.3.HPV感染的分子生物学诊断
• 1.3.1.HPV DNA检测
• 1.3.2.HPV抗体检测
• 二、乳头瘤病毒感染模型
• 2.1.乳头瘤感染动物模型
• 2.2.HPV组织培养模型
• 2.3.转基因动物模型
• 2.4.HPV假病毒感染模型
• 三、人乳头瘤病毒疫苗的研究进展
• 3.1.HPV治疗性疫苗
• 3.2.HPV预防性疫苗
• 3.2.1.类病毒颗粒（VLP）疫苗
• 3.3.HPV预防性疫苗的研究现状
• 3.4.疫苗研制中不同的表达体系
• 3.4.1.真核表达系统
• 3.4.2.原核表达系统
• 四、生物大分子三维结构研究
• 4.1.X射线晶体学
• 4.2.核磁共振波谱学
• 4.3.冷冻电镜与三维重构技术
• 4.4.HPV农壳蛋白及二十面体对称性原理
• 五、本研究的目的特点和意义
• 材料与方法
• 1.仪器
• 2.材料
• 2.1.菌株、细胞株、质粒和引物
• 2.1.1.大肠杆菌菌株
• 2.1.2.质粒
• 2.1.3.HPV18基因全长序列
• 2.1.4.引物
• 2.1.5.实验动物
• 2.2.酶和单抗
• 2.3.其他试剂
• 2.4.常用溶液和培养基的配制
• 2.4.1.LB培养基
• 2.4.2.LB固体培养基
• 2.4.3.氨苄青霉素储存液
• 2.4.4.卡那霉素储备液
• 2.4.5.选择性培养基
• 2.4.6.碱法提取质粒溶液Ⅰ
• 2.4.7.碱法提取质粒溶液Ⅱ
• 2.4.8.碱法提取质粒溶液Ⅲ
• 2.4.9.Tris—饱和酚
• 2.4.10.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）
• 2.4.11.TE缓冲液
• 2.4.12.50×TAE缓冲液
• 2.4.13.DNA电泳凝胶加样缓冲液
• 2.4.14.无DNA酶的RNA酶
• 2.4.15.2×蛋白加样缓冲液
• 2.4.16.PBS
• 2.4.17.考马斯亮蓝染液
• 2.4.18.裂解液
• 2.4.19.蛋白SDS-PAGE试剂
• 2.4.19.1.1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）
• 2.4.19.2.1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）
• 2.4.19.3.10%SDS
• 2.4.19.4.10%过硫酸铵
• 2.4.20.Western blot用试剂
• 2.4.20.1.转移缓冲液
• 2.4.20.2.TN洗涤液
• 2.4.20.3.封闭液（WB用）
• 2.4.20.4.TNT洗涤液
• 2.4.20.5.HRP底物缓冲液
• 2.4.21.EIA用试剂
• 2.4.21.1.包被PB液
• 2.4.21.2.封闭液（EIA用）
• 2.4.21.3.PBST
• 2.4.21.4.样品稀释液
• 2.4.21.5.酶稀释液
• 2.4.21.6.山羊标准血清
• 2.4.21.7.兔抗羊HRP酶标抗体
• 2.4.21.8.羊抗兔HRP酶标抗体
• 2.4.22.单克隆抗体制备用试剂
• 2.4.22.1.RPMI—1640培养液
• 2.4.22.2.DMEM培养液
• 2.4.22.3.HAT培养液
• 2.4.22.4.HT培养液
• 2.4.22.5.完全RPMI-1640液
• 3.方法
• 3.1.PCR扩增反应
• 3.2.小量质粒快速提取
• 3.3.酶切方法
• 3.4.胶回收Kit回收片段
• 3.5.乙醇沉淀法回收线性质粒
• 3.6.连接反应
• 3.7.E.coli感受态细胞的制备
• 3.8.连接产物的转化
• 3.9.质粒DNA的转化
• 3.10.酶切鉴定
• 3.11.工程菌的小量诱导表达
• 3.12.工程菌的大量诱导表达
• 3.13.高压均质机的使用
• 3.14.利用切向流装置改变缓冲液体系
• 3.15.SDS-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
• 3.16.蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）
• 3.17.AKTA色谱纯化
• 3.18.分子筛层析分析
• 3.19.动态光散射实验
• 3.20.重组蛋白的透射电镜观察
• 3.21.计算机辅助分析与设计
• 3.22.疫苗原液的检定规程
• 3.22.1.蛋白质含量测定操作规程
• 3.22.2.蛋白质分子量测定操作规程
• 3.22.3.蛋白质纯度检定操作规程
• 3.22.4.蛋白质纯度检定——高效液相色谱法检定操作规程
• 3.22.5.宿主菌蛋白残留量测定操作规程
• 3.22.7.细菌内毒素检查检定操作规程
• 3.22.8.残余抗生素活性检查检定操作规程
• 3.22.9.紫外光谱测定操作规程
• 3.23.小鼠免疫实验和采血
• 3.24.小鼠单克隆抗体的筛选
• 3.24.1.脾细胞的选择
• 3.24.2.饲养细胞的处理
• 3.24.3.细胞融合
• 3.24.4.抗体检测
• 3.24.5.克隆化过程
• 3.24.6.单克隆抗体的制备
• 3.24.7.单克隆抗体的纯化
• 3.25.小鼠中和抗体的鉴定（假病毒中和实验）
• 3.26.中和抗体阻断实验
• 3.26.1.EIA包板
• 3.26.2.间接法EIA
• 3.26.3.单抗阻断抗血清实验
• 结果与分析
• 第一部分:HPV18疫苗的研制
• 1.HPV高效表达载体的构建
• 1.1.HPV18全基因组DNA的提取
• 1.2.非融合表达载体pTO-T7-HPV18N65C-L1的构建
• 2.HPV18L1纯化工艺的摸索及放大
• 2.1.HPV18 L1的高密度发酵表达
• 2.2.初纯工艺研究
• 2.2.1.菌体破碎条件的摸索
• 2.2.2.HPV18L1蛋白的硫酸铵沉淀纯化
• 2.2.3.HPV-18 L1蛋白的硫铵沉淀吹溶条件的摸索
• 2.3.HPV18 L1精纯条件的摸索
• 2.3.1.刚离子交换层析
• 2.3.2.层析介质选择
• 2.3.3.样品上柱盐浓度的摸索
• 2.3.4.不同pH条件下的纯化结果
• 2.3.5.分步洗脱条件的确定
• 2.3.6.工艺放大
• 2.3.7.第二步柱层析
• 2.3.8.工艺放大
• 3.HPV18 L1类病毒颗粒组装条件摸索
• 3.1.实验设计
• 3.2.复性方法及结果
• 3.3.不同复性速度的情况
• 3.4.工艺放大及回收率
• 4.HPV18疫苗原液检定
• 4.1.无菌检查
• 4.2.蛋白质含量
• 4.3.分子量测定
• 4.4.纯度
• 4.4.1.电泳+免疫印迹法
• 4.4.2.高效液相色谱（HPLC）
• 4.5.鉴别试验
• 4.6.抗原含量测定
• 4.7.宿主菌蛋白残留量
• 4.8.DNA残留量测定
• 4.9.肽图分析
• 4.10.紫外光谱测定
• 4.11.N-末端氨基酸序列测定
• 4.12.细菌内毒素检查
• 4.13.二硫苏糖醇（DTT）残余量检查
• 4.14.Tween-80含量测定
• 4.15.HPV18疫苗免疫原性检定
• 4.15.1.重组人乳头瘤病毒疫苗免疫BALB/c小鼠的半数有效剂量（ED50）和免疫持久性
• 4.15.1.1.抗原间接法测定
• 4.15.1.2.细胞中和实验
• 4.15.2.HPV18疫苗对恒河猴的免疫原性
• 4.15.2.1.ELISA检测
• 4.15.2.2.假病毒中和实验法检测
• 第二部分:HPV18中和单抗的鉴定
• 1.中和抗体优势表位的鉴定
• 1.1.HPV18单克隆抗体的筛选
• 1.2.中和抗体的筛选
• 1.3.优势中和抗体的筛选
• 1.3.1.间接法ELISA
• 1.3.2.单抗阻断山羊血清结合VLP实验
• 1.3.3.单抗阻断兔血清结合VLP实验
• 1.3.4.单抗互相阻断实验
• 2.HPV18 VLP与中和抗体11A9抗原抗体复合物的制备
• 2.1.单克隆抗体HPV18 VLP-11A9 Fab复合物的制备
• 2.1.1.11A9 Fab的制备
• 2.1.2.Fab-VLP复合物的制备
• 第三部分 HPV18 VLP冷冻电镜三维结构重建
• 3.1.HPV18 VLP三维结构立体几何分析
• 3.1.1.HPV18 VLP的对称性
• 3.1.2.HPV18 VLP手性分析
• 3.2.HPV18 VLP的结构分析
• 讨论
• 第一部分:HPV18 VLP疫苗的研制
• 1.1.HPV18表达系统的确立
• 1.2.HPV18纯化工艺的确立
• 1.3.HPV18复性工艺的确立
• 1.4.HPV18免疫保护性评价
• 第二部分:优势中和表位的鉴定
• 2.1.HPV18中和单抗的鉴定
• 2.2.HPV18优势中和单抗的研究
• 2.2.1.HPV18优势中和单抗的评价
• 2.2.2.HPV18优势表位的鉴定
• 第三部分、通过冷冻电镜及三维重建建立HPV18 VLP的三维模型
• 3.1.HPV18 VLP三维结构分析
• 3.2.解析精度的提高
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢