犬细小病毒分离鉴定及遗传进化分析

论文摘要

犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）是细小病毒科细小病毒属成员,为无囊膜、单股DNA病毒。由此病毒引起的犬细小病毒病于1978年首次报道。CPV能够迅速地传播,并以高发病率和高死亡率为特征。在挪威、比利时及希腊等国家对犬进行的回顾性血清调查研究显示,这些国家保存的七十年代初期的犬血清中都发现了抗犬细小病毒的抗体。这表明,上世纪七十年代初在犬群中就已经存在了CPV的感染。CPV对理化因素的抵抗能力强、能够通过消化道感染,并且各品种的犬对这种病毒都易感,这些因素使此病毒能够很快在世界范围内的犬群中传播流行。本研究进行了犬细小病毒（CPV）的分离鉴定、基因型调查及遗传进化分析等实验研究。从20092010年间从长春市收集了19份犬疑似细小病毒粪便样本,应用PCR方法进行检测,其中有17份样本为CPV阳性。应用F81细胞从17份CPV阳性样品中分离出9株病毒,经电镜观察、血凝试验、PCR扩增及序列测定等方法证明所分离的病毒为犬细小病毒。对17份CPV阳性样品及本实验室以往分离的犬细小病毒进行了CPV VP2全长基因的扩增并进行了测序,从而分析目前流行CPV的抗原型及CPV的基因变异情况。应用测定的CPV VP2基因序列共39条,通过序列比对及遗传进化分析,结果表明我国的犬细小病毒毒株存在基因变异现象,CPV-2a仍然是我国犬群中主要的流行毒株,同时也有CPV-2b及CPV-2c型犬细小病毒存在,其中本实验中检测到的CPV-2c为我国国内首次发现。在各株病毒的VP2基因序列中都存在个别点突变,但多数为同义突变。测定的17份样品中VP2基因序列,除03/09、07/09及17/09号样品VP2蛋白序列中没有发生324Y I氨基酸突变外,其余各样品VP2蛋白都有此位点的突变。文献报道称,此位点氨基酸在犬细小病毒进化过程中有较强的正向选择作用,在2004年以后我国分离或检测到的大部分CPV的VP2蛋白中发生了此位点的变异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验一 犬细小病毒的分离、鉴定
• 1 材料
• 1.1 细胞与病料
• 1.2 主要试验试剂
• 1.3 主要器材及仪器
• 2 方法
• 2.1 样品及分离培养的病毒液中DNA的提取
• 2.2 用PCR方法对样品进行CPV检测
• 2.3 病毒分离
• 2.4 分离病毒的鉴定
• 3 结果
• 3.1 粪便样品PCR检测结果
• 3.2 病毒分离结果
• 3.3 分离病毒鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 病毒分离
• 4.2 分离犬细小病毒鉴定
• 4.3 CPV的流行状况
• 5 小结
• 实验二 犬细小病毒VP2 基因克隆测序及遗传进化分析
• 1 材料
• 1.1 菌株及病毒样品
• 1.2 分子生物学试剂
• 2 方法
• 2.1 引物设计及PCR反应条件
• 2.2 PCR产物的克隆
• 2.3 序列的测定和分析
• 2.4 CPV-2c的RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism）鉴定
• 2.5 CPV VP2 蛋白高变区分析
• 2.6 细小病毒遗传进化分析
• 3 结果
• 3.1 VP2 全长基因PCR扩增结果
• 3.2 PCR产物连接T载体后质粒的鉴定
• 3.3 VP2 基因测定结果其推导的氨基酸序列比对分析结果
• 3.4 CPV-2c鉴定结果
• 3.5 VP2 蛋白高变异区分析
• 3.6 细小病毒遗传进化分析
• 4 讨论
• 4.1 CPV序列分析及其抗原性分析
• 4.2 在我国检测到CPV-2c
• 4.3 犬细小病毒的流行状况
• 5 小结
• 附录一 主要试剂的配制
• 附录二 VP2 变异分析使用的序列
• 附录三 上传CPV VP2 序列
• 中文综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢