藻酸钙凝胶复合同种异体胚胎骨膜细胞悬液移植修复骨缺损的实验研究

论文摘要

目的:由于各种原因所致的骨骼缺损是相关临床科室面临的棘手问题,植骨术是解决这一问题的主要方法。植骨术又大致分为自体来源植骨术、同种异体或异种植骨术以及当今研究比较热门的组织工程骨植骨术。前两种方法的弊端或局限性包括供源不足,导致供区损伤和并发症、移植免疫反应等。而利用组织工程学原理和方法构建的组织工程骨移植可克服这些不足和弊端,为骨缺损的修复提供了全新的思路和方法。组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理,研究开发修复和改善损伤组织形态和功能生物替代物的一门科学,骨组织工程包含三个关键因素:信号分子（骨生长因子、骨诱导因子）、支架材料、靶细胞。藻酸钙凝胶是一种理想的组织工程支架材料,目前其在骨科创伤修复方面的应用是组织工程学的研究热点。其作为支架材料具有以下特点:（1）具有良好的生物相容性;（2）具有良好的生物降解性或生物吸收性;（3）支架材料的降解速率应与骨形成能力相匹配;（4）具有良好的多孔性能;（5）具有很强的渗透能力。藻酸钙凝胶在组织工程骨（软骨）、药物缓释系统和细胞三维培养等多方面得到了广泛应用。骨膜分为纤维层和生发层,生发层有成骨能力故又称成骨层,其细胞成分有骨祖细胞、成骨细胞、破骨细胞和血管内皮细胞。在胚胎期和出生后的成长期内生发层由数层细胞组成其外层为成纤维细胞样骨祖细胞,内层为成骨细胞,二者皆有增殖能力,且有较强的成骨能力。胚胎骨膜免疫排斥反应很轻微,自身成骨作用强,是比较好的种子细胞提供物。本实验将经过二步冷冻法的胚胎骨膜制备成细胞悬液,均匀混于藻酸钙凝胶中,充分发挥了骨传导、自身成骨及骨诱导三方面作用,用来修复骨缺损。本实验是在总结前人研究经验的基础上,观察藻酸钙凝胶复合同种异体胚胎骨膜细胞悬液在自体环境中能否成骨,以及成骨的方式,从而寻找一种治疗骨缺损的便于临床应用的新方法。方法:选用孕2628天孕兔10只,剖腹取胎兔,将胎兔颅骨骨膜锐性剥离,分装入含PBS、DMEM与二甲基亚砜混合液的冻存管中,经过二步冷冻法在-198℃的液氮中保存24小时。37℃水浴快速复温,将胎兔骨膜制成细胞悬液。选用成年新西兰白兔80只,随机分为四组,每组20只,所有动物左侧桡骨造15mm标准骨缺损后,A组植入藻酸钙凝胶/胚胎骨膜细胞悬液;B组植入藻酸钙凝胶;C组植入胚胎骨膜细胞悬液;D组为空白对照。术后在2、4、6、8、12周分别取材,每次每组动物处死4只,将标本仔细去除肌肉后进行大体观察、X-线检查、组织学观察、同时测定血清碱性磷酸酶、血清钙水平。从宏观和微观两方面观察骨形成情况,并进行评分以及统计分析。结果:术后2、4、6、8、12周进行大体观察、组织学观察、X-线影像学及血清生化检查。结果表明:A组,移植区域存在明显的成骨,有连续骨痂通过缺损处,骨塑型良好,新骨增生明显,主要以多中心软骨成骨方式出现,髓腔逐渐再通,骨重建顺利,骨缺损完全修复。无急性免疫排斥反应表现。B组,移植区在两断端有部分骨形成,中间部分无骨连结,为结缔组织占据。C组,大部分标本表现出贴近尺骨处成骨,亦能形成连接,其余移植区被结缔组织占据,新骨生长、骨重建少而且缓慢,其余标本无成骨,移植区完全被结缔组织占据。亦无免疫排斥反应表现。D组全部标本在两断端骨质硬化、髓腔闭死,中间无骨连接,结缔组织填塞。组织学观察显示:A组,藻酸钙凝胶未降解之前,成骨过程迅速,主要是向成软骨方向,并建立起细胞支架,4周后,藻酸钙凝胶逐渐降解,同时软骨逐渐成骨,8周时,基本完成骨缺损修复,新生小血管增生明显,骨小梁排列有序,成熟骨组织替代完全,与断端无明显分界;早期植入物交界处有弥散的淋巴细胞浸润,偶可见嗜酸粒细胞,6周时消失;B组,藻酸钙凝胶未降解之前,有部分爬行替代过程,两断端向中间成骨,4周后,藻酸钙凝胶逐渐降解,该过程停止,中间缺损区存在大量结缔组织;C组,骨膜细胞附着于尺骨骨膜生长,尺骨骨膜亦增厚,有部分小血管向移植区生长,但移植区大部分充填了结缔组织,骨生长受挤压,形成骨量少,骨小梁排列无序,类似编织骨;早期植入的细胞生长良好,呈长梭形,并互相连接,其间可见少量的淋巴细胞和多核巨噬细胞,6周时消失;D组,无骨生长,移植区为结缔组织填充。X-线观察显示:A组,移植区大量骨痂形成,骨缺损模糊,很快被新生骨填充;B组,缺损明确存在,两端有部分骨质增生;C组,小部分缺损修复,仅有很少的骨膜反应,骨痂形成少;D组,无骨痂生成,骨不连接。生化数据结果显示:A、B、C三组在前四周都有成骨现象,A组的血清钙、碱性磷酸酶水平高于B、C两组,B、C两组无明显差异,六周时,A、C两组的血清钙、碱性磷酸酶水平仍较高,B组已恢复到术前水平,A组高于C组,八周时,A组恢复到术前水平,C组高于A、B两组,十二周时,三组均恢复到术前水平。结论:1胚胎骨膜细胞是骨种子细胞的可靠来源,在成骨合适载体中成骨作用强,并主要以软骨内成骨为主,形成多中心成骨。2经过二步冷冻法处理的同种异体胚胎骨膜细胞悬液与移植宿主机体有良好的组织相容性。3藻酸钙凝胶具有良好的组织相容性、生物降解性、可塑形性和多孔性,是一种良好的组织工程学材料。4同种异体胚胎骨膜细胞悬液-藻酸钙凝胶复合体在自体内成骨作用良好,无不良反应,易于临床掌握和应用。5藻酸钙凝胶载体存在机械性能较差的问题,适于在不受力或少受力的部位使用或在给予有效的内、外固定的条件下使用。总之,藻酸钙凝胶复合同种异体胚胎骨膜细胞悬液移植充分发挥了骨传导、自身成骨及诱导成骨三方面作用,且操作简便,易于临床掌握和应用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 藻酸钙凝胶复合同种异体胚胎骨膜细胞悬液移植修复骨缺损的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 藻酸钙凝胶构建组织工程骨修复骨缺损的研究进展
• 致谢
• 个人简历