鲫鱼PKR-like Zα结构域与核酸的亲和性及趋化因子等蛋白质的适应性进化

论文摘要

鲫鱼PKR-like（CaPKR-like）N-端由2个Z-DNA结合域（Zα1和Zα2）组成，属于一个Z-DNA结合蛋白家族。为理解Zα结构域的功能，本文原核表达并纯化Zα野生型(PZα1、PZα2、PZα3)以及突变型(PZα38N、PZα60W)蛋白。凝胶阻滞试验分析Zα蛋白与pMD18-T质粒、重组d（GC）13质粒以及Poly I∶C的亲和性，结果显示：Pzα与d（GC）13重组质粒和Poly I∶C有明显的结合，而PZα1、PZα2则不与它们结合；但即使是PZα，也对不含有d（GC）13序列的pMD18-T质粒没有结合能力，说明PZα结合d（GC）13重组质粒可能是结合质粒上的d（GC）13片段。溴化乙锭能解旋质粒的负超螺旋，这降低了PZα与质粒DNA分子的结合活性。点突变试验证实38N和60W两个氨基酸残基可能在PZα结合核酸分子的过程中起重要作用。密码子替换模型是检测基因序列单个密码子位点选择作用的统计学方法，能够有效地检测基因在进化历程中是否受到选择作用，并且可以预测出那些在进化过程中对功能分化有重要贡献的、受正选择作用的密码子位点。为更好地理解Zα的功能，利用该模型分析了Zα同源序列的适应性进化。结果：在Zα中没有检测到正选择作用，说明Zα同源序列有很强的进化保守性。分析干扰素家族分子适应性的结果显示，干扰素基因α和γ都受到正选择作用。转铁蛋白是一个能和铁离子结合的蛋白质家族，从血清中向细胞内运输铁离子，或在生物体液中帮助调节铁离子水平。分子适应性进化分析表明，较保守的转铁蛋白受到正选择作用。正选择位点大多集中在转铁蛋白的C-臂，且二级结构大多是无规则区域，即非α螺旋也非β折叠。这些正选择位点可能与调节转铁蛋白N-臂和C-臂结合铁离子有关。趋化因子是一类控制免疫细胞定向迁移的细胞因子，其功能行使由趋化因子受体介导。发现只有少数种类基因受到正选择作用，如RANTES、CCR5等，并预测出一些可能受到正选择作用的位点，蛋白3D分析显示，它们均位于趋化因子和相应受体相互作用的结构区域。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 鲫鱼PKR-like Zα结构域与核酸的亲和性
• 1 综述
• 1.1 Z-DNA的存在
• 1.2 Z-DNA结构与功能
• 1.2.1 B-DNA与Z-DNA的junction
• 1.2.2 Z-DNA的形成及功能
• 1.3 Z-DNA结合蛋白家族
• 1.3.1 ADAR1
• 1.3.2 痘类病毒E3L
• 1.3.3 DLM-1（ZBP1）
• 1.3.4 鱼类PKR-like（PKZ）
• 1.4 Zα的结构
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂、试剂盒
• 2.3 质粒和菌株
• 2.4 相关软件
• 2.5 Zα蛋白定点突变
• 2.5.1 引物设计
• 2.5.2 质粒模板处理
• 2.5.3 PCR扩增突变产物
• 2.5.4 测序鉴定
• 2.6 原核表达
• 2.7 His-Bind蛋白纯化
• 2.7.1 超声波破碎细菌
• 2.7.2 His-Hind亲和层析
• 2.7.3 透析
• 2.8 Bradford法测定蛋白质浓度
• 2.8.1 标准曲线的测定
• 2.8.2 样品的测定
• 2.8.3 数据处理
• 13质粒的构建'>2.9 重组d（GC）₁₃质粒的构建
• 2.10 凝胶阻滞实验
• 3 实验结果
• 3.1 PCR法定点突变
• 3.2 蛋白原核表达及纯化
• 3.3 蛋白质浓度测定
• 13重组质粒的构建'>3.4 d（GC）₁₃重组质粒的构建
• 3.5 Zα蛋白与质粒DNA的结合
• 3.6 负超螺旋对Zα蛋白结合质粒DNA的影响
• 3.7 Zα蛋白与PolyI∶C的结合
• 4 讨论
• 第二章 Zα及趋化因子等蛋白的适应性进化分析
• 1 引言
• 1.1 最大似然法模型
• 1.2 密码子替换模型
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 序列材料
• 2.2 相关软件
• 2.3 适应性进化分析
• 2.3.1 序列的系统发生分析
• 2.3.2 密码子替换模型的参数估计
• 2.4 SWISS-MODEL同源模建
• 3 实验结果
• 3.1 Zα的适应性进化分析
• 3.1.1 Zα1同源序列系统发生树
• 3.1.2 Zα1正选择检验
• 3.2 Zα结构域的SWISS-MODEL同源模建
• 3.3 干扰素的适应性进化
• 3.3.1 哺乳类IFN-α的分析
• 3.3.2 哺乳类IFN-γ的分析
• 3.4 转铁蛋白的适应性进化分析
• 3.4.1 转铁蛋白的系统发生
• 3.4.2 数据分析
• 3.5 趋化因子家族的适应性进化分析
• 3.5.1 RANTES系统发生分析
• 3.5.2 RANTES的正选择检验
• 3.5.3 其他趋化因子基因的正选择检验
• 3.6 趋化因子受体家族的适应性进化分析
• 3.6.1 CCR5系统发生分析
• 3.6.2 CCR5的正选择检验
• 3.6.3 其他趋化因子受体正选择检验
• 4 讨论
• 4.1 鲫鱼PKR-like Zα的结构保守性
• 4.2 干扰素适应性进化分析
• 4.3 转铁蛋白的适应性进化分析
• 4.4 趋化因子及其受体家族分子适应性进化分析
• 4.4.1 RANTES的结构、功能与适应性进化
• 4.4.2 CCR5的结构、功能与适应性进化
• 4.4.3 趋化因子及其受体的演化分析
• 第三章 小结
• 参考文献
• 附录1:缩略语
• 附录2:论文列表
• 致谢