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农杆菌介导转Bt基因海岛棉技术体系的建立及抗虫性鉴定

2020-12-14阅读(324)

农杆菌介导转Bt基因海岛棉技术体系的建立及抗虫性鉴定

论文摘要

本研究通过对陆地棉和海岛棉下胚轴体细胞胚胎发生差异研究,探讨陆地棉和海岛棉组织培养过程中的差异,并且以新海30和新海16胚性愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法进行Bt基因的遗传转化,通过T1代PCR及T2代RT-PCR检测证实外源基因已整合到了海岛棉基因组中,获得转基因植株,对得到转基因株系进行初步的抗虫性检测,虫饲喂结果初步证实转基因植株具有抗虫性。本研究取得的主要成果如下1.以海岛棉和陆地棉无菌苗下胚轴为外植体,在采用相同的愈伤组织诱导和愈伤组织增殖基本培养基下,筛选海岛棉和陆地棉胚性愈伤组织分化的最佳条件,陆地棉胚性愈伤最适分化条件为：MSB添加1.9g/L KNO3,胚性愈伤组织分化率达到70%以上；海岛棉胚性愈伤组织分化条件：MSB添加1.9g/L KNO3,和0.3mgLNAA；胚性愈伤组织分化率达到60%以上。陆地棉胚性愈伤组织增殖培养基为：MSB中添加1.9g/L KN03并添加2.0g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺；海岛棉胚性愈伤组织增殖培养基为：MSB中添加3.8g/L KN03并添加2.0g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺。2.海岛棉体细胞形态建成培养基：MSB中KN03加倍并添加2.0g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺及0.05mg/L IBA。3.农杆菌介导海岛棉新海30和新海16的胚性愈伤组织,获得转Bt基因的转基因植株。转化条件为：海岛棉胚性愈伤组织于OD值为0.5-0.6的菌液中浸染15min后共培养24h。处理完毕后,将胚性愈伤组织转入添加50mg/L卡那霉素及400mg/L头孢霉素的培养基中,诱导转基因体细胞胚胎分化。抗性子叶胚最佳成苗培养基1/2MSB添加300mg/L头孢霉素和gelrite 2g/L。4.获得的T1代转基因植株进行卡那霉素初步检测,检测结果显示卡那霉素抗性率为12.6%。将卡检阳性的植株进行PCR检测初步筛选转基因植株,并对T1代转基因植株进行抗虫性初步测定,结果显示转基因海岛棉具有一定的抗虫性。将获得的T1代转基因海岛棉经组织培养后获得T2代组培苗,并对T2代转基因植株进行RT-PCR检测,结果显示Bt基因在T2代转基因植株中能够正常传递。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 引言
  • 1.1 棉花组织培养研究现状
  • 1.1.1 棉花体细胞胚发生研究进展
  • 1.1.2 花药培养
  • 1.1.3 茎芽培养
  • 1.1.4 胚珠和胚培养
  • 1.1.5 原生质体培养
  • 1.2 棉花转基因研究现状
  • 1.2.1 棉花转基因方法
  • 1.2.2 国内外转基因研究进展
  • 1.2.3 转基因抗虫棉研究进展
  • 1.3 转基因植物常用检测与鉴定
  • 1.3.1 基于蛋白质的检测方法
  • 1.3.2 基于核酸的检测方法
  • 1.4 研究目的和意义
  • 第2章 陆地棉和海岛棉再生条件差异研究
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 种子处理及发芽
  • 2.1.3 棉花愈伤组织的诱导
  • 2.1.4 棉花愈伤组织的增殖
  • 2.1.5 陆地棉和海岛棉愈伤组织分化
  • 2.1.6 硝酸盐浓度对陆地棉和海岛棉胚性愈伤组织增殖的影响
  • 2.1.7 硝酸盐浓度海岛棉体细胞分化的影响
  • 2.1.8 激素对海岛棉体细胞分化的影响
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 棉花愈伤组织的诱导
  • 2.2.2 棉花愈伤组织的增殖
  • 2.2.3 棉花愈伤组织的分化
  • 2.2.4 硝酸盐浓度对棉花胚性愈伤组织增殖的影响
  • 2.2.5 硝酸盐浓度对海岛棉体细胞胚胎分化的影响
  • 2.2.6 激素对海岛棉体细胞胚胎分化的影响
  • 2.3 讨论
  • 2.3.1 海岛棉和陆地棉愈伤组织诱导率和诱导状态差异
  • 2.3.2 陆地棉和海岛棉愈伤组织分化条件差异
  • 2.3.3 陆地棉和海岛棉胚性愈伤组织增殖条件的差异
  • 2.3.4 棉花体细胞分化
  • 第3章 农杆菌介导棉花胚性愈伤组织遗传转化的研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 植物材料与载体
  • 3.1.2 培养基
  • 3.1.3 农杆菌介导棉花胚性愈伤组织遗传转化体系的建立
  • 3.1.4 影响棉花胚性愈伤转化影响因子研究
  • 3.2 结果分析
  • 3.2.1 浸染时间对农杆菌介导的影响
  • 3.2.2 共培养时间对产生抗性愈伤率的影响
  • 3.2.3 抗性胚状体成苗条件的优化
  • 3.3 讨论
  • 第4章 转Bt基因海岛棉的抗虫性功能验证
  • 4.1 材料和方法
  • 4.1.1 试剂和溶液
  • 4.1.2 转基因棉花卡那检测
  • 4.1.3 转基因棉花PCR检测
  • 4.1.4 转基因抗虫棉抗虫性测定
  • 4.1.5 转基因棉花R-TPCR检测
  • 4.2 结果与分析
  • 1代卡那霉素检测结果分析'>4.2.1 T1代卡那霉素检测结果分析
  • 4.2.2 转Bt基因海岛棉植株PCR检测
  • 4.2.3 转抗虫基因棉花的抗虫性测定
  • 2代植株'>4.2.4 RT-PCR检测转Bt基因T2代植株
  • 4.3 讨论
  • 第5章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 相关论文文献

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